土茯苓含量测定色谱分离度和理论板数的调整.docVIP

土茯苓含量测定分离度和理论板数的调整 摘要：目的：为准确测定土茯苓中落新妇苷的含量，探索提高理论板数、分离度的方法。方法：采用不同品牌色谱柱，调节流速，进样量，色谱柱温度，分别测定落新妇苷的保留时间、分离度、理论板数。结果：色谱柱、流速、进样量、色谱柱温度等的不同均可影响高效液相色谱的保留时间、分离度、理论板数。结论：在高效液相色谱测定时，可通过采用不同品牌的色谱柱，调整流速、进样量、色谱柱温度等方法改善液相色谱的分离度、理论板数。 关键词：高效液相色谱法；分离度；理论板数 在药品检验含量测定时，高效液相色谱法是常用的方法，药品标准在含量测定项下对理论板数有明确规定；《中国药典》附录高效液相色谱法中对分离度也有规定，“除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。”这些规定保证了待测成分测定结果的准确???但由于色谱柱的长期使用，柱效降低，或者样品中成分复杂，某些成分变化，待测成分经过色谱柱后与其他成分不能完全分离，导致理论板数或分离度不符合规定。笔者在测定土茯苓药材落新妇苷的含量时，针对待测成分落新妇苷与其他成分不能完全分离、理论板数低的情况，按照《中国药典》规定，对高效液相色谱的流速、柱温、进样量等进行调整，采用不同品牌的色谱柱进行比较，结果表明，色谱条件中如果选择合适的流速、柱温、进样量，可改变待测成分的保留时间（tR），提高理论板数（N）、分离度（N）等，使之符合要求，保证了测定结果的准确。 1仪器与试药 WATERS2695液相色谱仪；落新妇苷对照品(批号：111798 -201102)；土茯苓对照药材（批号：121439-200401）（由中国药品生物制品检定所提供）；试剂为分析纯，甲醇为色谱纯。 2方法与结果 2.1土茯苓中落新妇苷的含量测定方法 色谱条件、对照品溶液制备及供试品溶液制备采用《中国药典》土茯苓[含量测定]项下方法。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%冰醋酸溶液(39：61)为流动相；检测波长为291nm。理论板数按落新妇苷峰计算应不低于5000。 对照品溶液的制备 取落新妇苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每ImL含0.2mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品粉末（过二号筛）约0.8g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇lOOmL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.2不同品牌色谱柱对保留特性的影响 采用不同品牌色谱柱进行测定，色谱柱分别为DiscoveryC18（150mm×4.6mm,5μm）和WondasilC18（150mm×4.6mm,5μm），进样量为10μL，流速为0.7mL/min，柱温为30℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定保留时间、分离度、理论板数，数据见表1。 表1 不同品牌色谱柱对保留时间、分离度、理论板数的影响 DiscoveryC18WondasilC18tR/min7.01113.141R1.351.75N54485002不同品牌色谱柱在测定土茯苓中的落新妇苷时，保留时间、分离度、理论板数不相同，其中DiscoveryC18分离度较差，分析原因为此柱已使用较长时间，但理论板数均符合规定。 2.3不同流速对保留特性的影响 采用DiscoveryC18色谱柱，进样量为10μL，流速分别为0.3mL/min、0.5mL/min、0.7mL/min、1mL/min，柱温为30℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定保留时间、分离度、理论板数，数据见表2。 表2 不同流速对保留时间、分离度、理论板数的影响 0.3mL/min0.5mL/min0.7mL/min1mL/mintR/min16.2519.8037.0114.955R1.581.471.351.27N7091623854484796调整流速可改变测定成分的分离度，流速减少，可使保留时间增加，分离度提高，理论板数增加，可通过减少流速的办法提高分离度和理论板数；但流速的增加与保留时间的减少呈倒数关系，流速减少多少倍，保留时间增加相同的倍数，即减少流速导致测定时间增加。 2.4不同进样量对保留特性的影响 采用WondasilC18色谱柱，进样量分别为1μL、2μL、5μL、10μL、15μL，流速为0.7mL/min，柱温为30℃，按照土茯苓中落新妇苷的含量测定方法，测定分离度、理论板数，数据见表3。 表3 不同进样量对分离度、理论板数的影响 1μL2μL5μL10μL15μLR1.821.791.761.751.72N50835034