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实验六 现代免疫学检测技术： ELISA ;1.了解ELISA的原理及其优点， 2.掌握试剂盒的使用。 3.学习ELISA的实验操作过程及其应用。;免疫酶技术 （酶免疫测定法）;ELISA简介;ELISA基本的实验过程;ELISA：根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。 ; (1) 包被固相抗体（室温放置，厂家完成）;;ELISA检测—双抗原夹心法（测抗体）;酶标板;酶标仪;三、实验内容;1．乙肝病毒表面抗体(HBsAb)诊断试剂盒。 预包被微孔条（包被纯化HBsAg） 酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAg （ HBsAg-HRP ） 抗HBs阳性对照 抗HBs阴性对照 洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释，按说明) 底物A（ H2O2 ）、底物B（四甲基联苯胺TMB）和终止液（HCl及2 mol/L H2SO4）。;2．乙肝病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒。 　预包被微孔条（包被纯化HBsAb） 　酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAb （ HBsAb-HRP ） 　 HBsAg阳性对照血清 　 HBsAg阴性对照血清 　洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀，按说明) 　底物A、B和终止液。 3．微量加样器，吸水纸等。;1.待检测样品 待测血清4种：1号、2号、3号、4号 注意：待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体)，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要注意安全。;2.分组：每4人一组，每组有检测HBsAg和检测抗体（抗－HBsAg）的2种试剂盒。反应条各1条, 每条含6个反应孔。 1个孔做阳性对照，1个孔阴性对照，4个做样品检测。本实验空白对照孔不设。;3.检测方法;阴性 阳性 待检血清1号,2号,3号，4号………. 对照 对照 ;(2)每孔加1滴酶结合物 , 充分混匀，37℃孵育30min。 (3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）； (4)每孔加满洗涤液,静置1min, 甩干。 同上洗涤重复4次，拍干。;(5)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min（水浴锅的盖子上面水擦干净）。 按以下方法,进行肉眼观察结果: 阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色; 待测孔显蓝色, 为阳性,否则为阴性。 （记录颜色！） (6)加终止液：各孔加终止液1滴，反应条取出，放入消毒缸。;4.实验结果及结论;HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。 在中国，HBV感染或携带者已超过1.3亿，发病人数超过3000万人。HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单链区。 HBV的抗原组成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)组成。三种抗原具有其相应抗体： HBsAb（抗表面抗原抗体）、 HBeAb （抗e抗原抗体）、 HBcAb （抗核心抗原抗体）。;HBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为HBV感染的主要标志； HBcAg存在于Dane颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被HBsAg覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗-HBc，抗-HBc IgM的存在提示HBV处于复制状态； HBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及DNA多聚酶消长基本一致，故HBeAg为HBV复制及具有强感染性的一个指标； ;HBeAg刺激机体产生的抗- HBe能与受染肝细胞表面的HBeAg结合，通过补体介导破坏受染肝细胞，抗- HBe的出现是预防后良好的象征。 HBV的主要感染源是患者或无症状的HBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。 本实验只检测HBsAg及其抗体HBsAb ;HBsAg（本实验测）;【注意事项】 　　1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。 　　2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。 　　3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。 　　4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。 　　5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。;临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因?（非试剂盒本身的原因）? ;2．测定的重复性差??（相同样本两次测定结果不一致）?这是典型的由测定操作引起的问题，包括?（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；?（2）加样过快，孔间发生污染；?（3）加错样本；?（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；?（5）不同批号试剂盒中组分混用；; （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；?（7）孔内污染杂