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原位杂交实验
1 探针的设计与合成
根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列,用premier primer5.0设计引物p81和p82,以卤虫cDNA为模板,PCR扩增得到346bp的产物,用Takara胶回收试剂盒回收纯化。
引物编号引物序列长度p81TGCGGACGAAACAGGAAG18 bpp82GCTCAAACAGTGATGCCAGT20 bp目的片段克隆
a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分,载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下:
目的PCR片段 5 μl
pGM-T载体(约50ng/uL) 1 μl
10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl
T4 DNA Ligase(3U/uL) 1 μl
无菌去离子水 3 μl
总体积 10 μl
b. 轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接,反应结束后将离心管置于冰上。
c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG(50mg/ml)、40 μl的X-gal(20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于37℃培养箱1-3小时,使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。
d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5?感受态细胞中,轻弹混匀,冰浴半小时,将离心管置于42℃水浴90秒,取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟,其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基,150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟,去掉上清,加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培养12-16小时。
e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测,筛选转化子。
f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时,吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。
重组质粒的线性化
取6 μl以测序的重组质粒,选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl:
质粒 6 μl
10xK Buffer 2 μl
NcoI酶 1 μl
0.1% BSA 2 μl
灭菌水 9 μl
终体积 20 μl
取酶切前后的质粒各4 μl,经1%琼脂糖电泳检测,确认酶切完全,将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化,作为探针合成的模板。
探针合成
按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南,标记反义RNA探针。
使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理,合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:
纯化的线形质粒 1 μg
Rnase-free dH2O up to 13 μl
10xNTP labeling mixture 2 μl
10xTranscription buffer 2 μl
Rnase inhibitor 1 μl
SP6 RNA Polymerase 2 μl
总体积 20 μl
稍混匀,短暂离心将反应液集于管底,37℃ 2 h。反应结束后再补加2 μl DNase I,37℃ 15 min,反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取3-5 μl 反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。-20℃保存备用。
2. 石蜡切片的制备
◆本实验在杂交结束前均必须保证RNase-free.玻璃器皿采用180℃烘烤10小时。其它采用DEPC处理,高温灭菌锅高温降解DEPC。若仪器不能高温处理,可用3%的H2O2处理半小时以上,DEPC水冲洗干净,烘干。
组织的固定与包埋
选取不同发育时期(0h,5h,10h,15h,20h,40h,3d,5d,7d)的卤虫,经DEPC处理水冲洗表面盐分后,加入新鲜配制的4%多聚甲醛,于4℃固定5-8 h,再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水1 h,50%乙醇脱水1 h,70%乙醇脱水1 h,80%乙醇脱水乙醇
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