实验4PCR技术在动物传染病诊断中的作用.pptVIP

;聚合酶链式反应;聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)简称PCR，是一种选择 性体外扩增DNA或RNA的方法。 PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促 扩增法，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。 ; 模板DNA或RNA 特异性引物: sense和 antisense Taq酶：耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR缓冲液： 10mmol/LTris-HCl pH8.4 50mmol/L KCl Mg2+ 0.1mg/mL乙酰BSA;模板DNA ;引物设计注意事项;引物设计注意事项;引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性 长度：15—30bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 40-60%） 引物内部不能形成二级结构 两引物间没有互补链存在 3’端一定要与模板严格配对 5’端可引入突变，加酶切位点等 辅助软件：primer5，Oligo，DNAsis等;primer5.0操作界面;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 ; dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mM/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为2.5mM/L。当dNTP终浓度大于50mM/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 ; Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。;TITRATE YOUR Mg2+ CONCENTRATION!; 就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102 -105??拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。; 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。; TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min， 97℃ 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。TaqD