病毒血凝和血凝抑制试验--以新城疫为例.docVIP

实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例） 实践目的： 1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理： 某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。 实践内容： 1．红细胞凝集试验(HA试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。 鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。 (2)用微量移液器取病毒抗原液25μl加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混???均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加1.0％红细胞悬浮液1滴(25μl)。 (4)在振荡器上振荡混匀约l～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。 (5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。 表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法) 孔号123456789101112 病毒稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl病毒液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl 弃去1％红细胞悬液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟 结果例示#######++----# 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集 结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。 2.红细胞凝集抑制试验(HI试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。 (1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25μl)，从第1孔到第10孔。第1l孔加稀释液2滴(50μl)。 (2)以微量移液器取被检血清25μl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25μl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。 (3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25μl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。 (4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。 (5)每孔再加入1.0％红细胞悬浮液1滴(25μl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定结果。 表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法) 孔号123456789101112被检血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024红细胞 对照抗原 对照生理盐水25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl50μl25μl被检血清25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl 弃掉4单位病毒液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟