第8章酶免疫技术.pptVIP

;教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理 4.掌握酶免疫测定的应用;放射免疫技术;;基本原理;基本原理;一、酶和酶作用底物;辣根过氧化物酶（HRP） ;DH2+H2O2→ → → D+2H2O ;邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。;（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP) ;（三）β-半乳糖苷酶 （β-galactosidase，β-Gal） ;二、酶标记抗体或抗原;（一）酶标记抗体或抗原的制备;制备方法;（二）酶标记物的纯化与鉴定; 2.酶标记物的鉴定;三、固相载体 ;（一）固相载体的要求;（二）固相载体的种类;;（三）包被与封闭;以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程： 　　抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶液稀释　→　 4oC过夜　→　用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。;第二节 酶免疫技术的分类;一、均相酶免疫测定法;一、均相酶免疫测定法;二、异相液相酶免疫测定法;第三节 酶联免疫吸附试验（ELISA）;二、方法类型及反应原理; E;（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。 ;（+）;2.双位点一步法检测抗原; E; ; 如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。;3.竞争法检测抗原;酶标抗原;（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。; ;（二）检测抗体的方法; ; ;2.双抗原夹心法;;4.加酶作用的底物;3.竞争法检测抗体;（1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;3.加酶作用的底物;（2）竞争法检测HBeAb： ①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。 ③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。 ④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;固相抗体;;4.捕获法;固相抗人lgM抗体;5.加酶作用的底物;方法评价;试剂盒;;（图为瑞士HAMILTON FAME24/20全自动酶免分析仪）;1．病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊断。 2．蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。 3．非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。 4．药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。;小 结;展 望 ;练 习;1.用于标记的HRP的RZ值应该大于 A.2.4 B.3.0 C.1.5 D.3.5 E.5.0;1.用于标记的HRP的RZ值应该大于B A.2.4 B.3.0 C.1.5 D.3.5 E.5.0;2.RZ表示 A酶活性 B.催化效率 C.标记率 D.酶纯度 E效价;2.RZ表示D A.酶活性 B.催化效率 C.标记率 D.酶纯度 E.效价;3.HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A.278mm B.450mm C.403mm D.495mm E.492mm;3.HRP与底物TMB反应后的测定波长为B A.278mm B.460mm C.403mm D.495mm E.492mm;5.HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A.蓝色 B.橙黄色 C.棕黄色 D.黄色 E.紫色;5.HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈D A.蓝色 B.橙黄色 C.棕黄色 D.黄色 E.紫色;6.辣根过氧化物酶（HRP）的受氢底物为 A.OPD B.TMB C.DAB D.H2O2 E.Eu;6.辣根过氧化物酶（HRP）的受氢底物为D A.OPD B.TMB C.DAB D.H2O2 E.Eu;7.ELISA常用的固相材料为 A.NC膜 B.聚苯乙烯 C.磁性颗粒 D.尼龙