实验材料与方法模板.docVIP

1 材料与方法 1.1实验材料 1.2实验方法 1.2.1 MjCBP RNA水平组织分布和表达模式 1.2.2 MjCBP的克隆，重组表达载体的构建 1.2.3 MjCBP蛋白的重组表达、纯化 （1.2.4 MjCBP多克隆抗体制备） （1.2.5 MjCBP蛋白水平组织分布、表达模式） 1.2.6 干扰后弧菌清除实验，过表达后弧菌清除实验 2 实验结果 2.1 进化树 2.2 组织分布和表达模式 2.3 纯化 2.4 弧菌刺激 血、肠 进化树 使用ClustalW1.8 软件, 将剑尾鱼P-gp 推断的氨基酸序列与GenBank 中登录的其他动物P-gp 进行多序列比对, 采用MEGA4.0 软件包进行构建系统树。 用NCBI BALST(http：//blast．ncbi．nlm．nih．gov／blast．cgi)、ExPASy_ProtParam(http：／／web．expasy．org／protpa—ram／)、PredictProtein(http：／／www．predictprotein．org／)、SignalP 4．1 Server(http：／／www．cbs．dtu．dk／cgi—bin／1和NCBI CDD(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Structure／cdd／)等在线工具对猪MNSF[3的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析 用DNAMAN软件对猪MNSF[3与人、小鼠等18个物种的MNSFl3进行蛋白相似性分析和进化树分析。 猪MNSFl3与其他物种MNSFIB的同源性分析利用NCBI BLAST在GenBank中搜索不同物种MNSFl3的同源序列，用DNAMAN软件对克隆得到的猪MNSFl3与18个不同物种的MNSFp蛋白序列进行相似性比对并绘制MNSFIB蛋白无根进化树。在蛋白水平上，猪MNSFl5与其他18个物种的相似性在91．73％～97．74％之间，与小鼠MNSFl3蛋白相似性最高，达到97．74％，与人的MNSFl3蛋白相似性为93．98％(附表1)。MNSFl3蛋白的无根进化树分析结果显示猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、绵羊(Ovisaries)、虎鲸(Orcinus orca)和宽吻海豚(Tursiops truncatus)可聚成一类，亲缘关系较近。在所有比较的物种中其进化距离都小于o．05，说明MNSFl3在不同物种间高度保守(附图2)。 从转录组文库中获取得到橘小实蝇8个Rab基因的核苷酸序列信息。用DNAman完成核苷酸序列编辑及氨基酸序列推导。通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点的BLASTX 0attp：／／www．nebi．nlm．nih．gov)查找各Rab基因的高相似性序列。用ClustalX 2．0对橘小实蝇Rab家族基因氨基酸序列进行多重比对，分析其保守性，揭示其活性位点。用MEGA5．0软件neighbor-joining方法对8个Rab基因构建进化树，根据bootstrap方法用1000个重复进行统计分析。 从NCBI中查找到的与橘小实蝇BdRabl氨基酸序列相似度较高的Rabl氨基酸序列所对应的不同昆虫，其中图3—2从上到下依次为欧洲熊蜂、印度跳蚁、顶端切叶蚁、佛罗里达弓背蚁、丽蝇蛹集金小蜂、赤拟谷盗、埃及伊蚊、橘小实蝇、黑腹果蝇、木槿曼粉蚧。其中橘小实蝇BdRabl与黑腹果蝇DmRabl进化距离最近。 组织分布 用实时荧光定量RT-PCR 法进行了P-gp 基因的组织分布 按照 QIAGEN RNeasy Mini Kit 试剂盒分别提取1.1 中保存的每尾剑尾鱼8 种组织总RNA, 每份RNA 作为１个样本, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性, 用核酸蛋白测定仪测定RNA样品的浓度和纯度。采用 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit进行反转录合成cDNA 模板。 荧光定量PCR在ABI 7500 (Applied Biosystems)实时荧光定量PCR仪进行, 目的基因的定量PCR引物序列(表1)。反应体系为20 μL: SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ(2×) 10 μL, ROX Reference Dye II (50×)0.4 μL, 20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL, cDNA 1 μL,加双蒸水补足反应总体积为20 μL。反应条件为: 95℃预变性30s; 然后95℃ 5s, 60℃ 34s, 扩增40个循环,60℃延伸时采集荧光信号, 反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析, 以确保特异性扩增。样本和内参分别设3个重复, 以β-actin作为内参基因校正实验误差。采用相对2?ΔΔCt法进行P-gp mRNA 在剑尾鱼各组织器官中的