贵州大学生物显微及超微技术实验教学大纲超微技术部分.docVIP

贵州大学生物显微及超微技术实验教学大纲 （超微技术部分） 一、 教学目的与要求 掌握透射电镜和扫描电镜的基本知识；了解透射电镜和扫描电镜的工作原理；了解其它新型电镜；掌握样品常规制备技术；了解免疫电镜、电镜细胞化学、冷冻蚀刻等技术；掌握正常细胞超微结构；了解细胞超微结构病理形态。使学生掌握电镜在生物医学领域中的使用方法。 二、课程内容 序号实验名称备注实验一透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍 电子显微镜的常规制样技术介绍2学时实验二植物花粉、叶片的扫描电镜观察4学时实验三微生物、动物的扫描电镜观察4学时实验四微生物样品（细菌、病毒）的负染色制备与观察6学时实验五超薄切片技术10学时实验六细胞超微结构的透射电镜观察6???时 教师：刘忠伟 电话 E-Mail 实验一 透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍 电子显微镜的常规制样技术介绍（理论课） ㈠ 序言 1．电镜发展史 2．电镜在生物医学中的作用 3．电镜进展：超高压电镜、扫描透射电镜、扫描隧道显微镜、分析电镜等 4．电镜与其它显微镜的区别 ㈡ 透射电镜 透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍 1．概述 2. 基本原理 3．结构和操作 ㈢ 扫描电镜 1．概述 2．成像原理 3. 结构和操作 ㈣ 超薄切片技术 1．电镜对标本的要求 2．标本制备过程 3．人工假象问题 ㈤ 扫描电镜样品制备 1．取材和予处理 2．生物样品干燥 3．生物样品导电 ㈥ 免疫电镜 1．概述 2．方法 3．免疫金探针技术 ㈧ 细胞超微结构 1．正常细胞超微结构 2．超微结构的病理变化 3．人工假象 实验二 叶片气孔及表皮细胞、花粉的扫描电子显微镜观察 一、 教学目的与要求 掌握扫描电镜的基本知识和工作原理，掌握扫描电镜植物样品常规制备技术；了解扫描电镜下植物组织的微观结构形态，熟悉扫描电子显微镜的操作。 二、课程内容 1、叶片气孔、表皮细胞观察： 取成熟植物叶片清洗后，切取中部约5mm 长的小段，经2.5％戊二醛4℃固定12 h以上，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗1次。 于26℃（即叔丁醇液态之温度）条件下用30%、50％、70％、90％的叔丁醇/酒精混合液各脱水5min；100％叔丁醇脱水两次，每次5min； 将试管中叔丁醇抽干，置4℃ 5～10min，待叔丁醇变为固态，冷冻干燥30～60min； 将脱水处理过的样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，S-3400N扫描电镜观察并拍照。 2、花粉： 取新鲜成熟的花粉，置于防尘处自然干燥（因花粉含水量少，可以采用直接干燥法观察）。 而后粘于导电胶上，用离子溅射仪镀金膜，扫描电镜观察并拍照。 实验三 微生物、小动物的扫描电子显微镜观察 一、 教学目的与要求 掌握扫描电镜的基本知识和工作原理，掌握扫描电镜微生物、动物样品常规制备技术；了解扫描电镜下微生物、动物组织的微观结构形态，熟悉扫描电子显微镜的操作。 二、课程内容 1、微生物样品的制样方法：细菌液体培养一段时间后，2000转离心弃上清，而后用2.5％戊二醛在4℃条件下固定12 h，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次，以便洗去固定剂；然后用1%锇酸溶液后固定1h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次。 在叔丁醇液态条件下用30%、50％、70％、90％的叔丁醇/酒精混合液各脱水5min；100％叔丁醇脱水两次，每次5min； 将试管中叔丁醇抽干，置4℃ 5～10min，待叔丁醇变为固态，冷冻干燥30～60min； 将脱水处理过的样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，S-3400N扫描电镜观察并拍照。 2、小动物及动物组织的制样方法： 取样品清洗后，用2.5％戊二醛4℃固定12 h以上，再用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次，然后用1%锇酸溶液后固定1h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次。 余下的步骤与1相同。 实验四 负染色 一、 教学目的与要求 掌握透射电镜的基本知识和工作原理，掌握透射电镜负染色样品的制备技术；了解透射电镜下负染色样品的微观结构形态，熟悉透射电子显微镜的基本操作。 二、课程内容 1、原理：负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色，背景因未被染色呈光亮。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)包埋低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像透明地光亮。与超薄切片正好相反，故称为负染色。对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15?)，简单快速