通过Blast数据库对抗EGFR纳米抗体单克隆抗体进行生物信息学分析.docx

生物信息学作业 通过Blast数据库对抗EGFR纳米抗体、单克隆抗体 进行生物信息学分析 学 院（系）： 生命科学与技术 专 业： 生物化工 学 号： 学 生 姓 名： 完 成 日 期： 2015-11-14 一．研究背景 表皮生长因子受体（EGFR）是酪氨酸激酶受体（RTK）ErbB家族的一员。生长因子受体与EGF家族蛋白结合后，将会被激活。研究表明，EGFR参与许多不同种类的肿瘤产生及发展转移的过程。EGFR蛋白在人类肿瘤细胞中过属于表达蛋白，在体内、体外实验均表明，EGFR蛋白可以引起肿瘤细胞的转移。EGFR作为药物作用靶点也成为目前抗肿瘤分子靶向研究中关注最为广泛、研究最为深入、最有前途的治疗靶点之一。 目前，针对抗EGFR作用的研究主要集中在EGFR的单克隆抗体和旨在阻断EGFR介导的信号转导通路的小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂上。骆驼科动物体内存在天然的缺失轻链的功能性抗体，此类抗体只含重链，克隆其可变区得到的仅含重链可变区的单域抗体称为纳米抗体。相较之传统单克隆抗体高成本、低稳定性等局限性，纳米抗体分子量很小且缺少Fc段，不会引起人体的免疫反应，生物相容性好，具有很强的组织穿透能力，能够进入致密的实体瘤组织，甚至能穿透血脑屏障发挥功效；而游离的纳米抗体也能被人体迅速清除，在医学领域具有得天独厚的优势。本实验室致力于通过基因工程学的方法表达抗表皮生长因子受体纳米抗体（nanobody of pidermal growth factor receptor ，EGFRnb），从而捕获肿瘤细胞，实现体内肿瘤细胞的清除或是靶向给药。 本组目前使用的抗EGFR纳米抗体PMP9G8序列为专利序列（附录1），在构建质粒的过程中对基因序列进行了密码子优化（附录2），对大肠杆菌密码子偏好性进行分析，减少了密码子兼并性。由于该种EGFR纳米抗体为商品蛋白，对其结构没有详尽的研究，所以在蛋白表达、纯化的过程中存在一定的盲目性；在今后的研究中我们试图对纳米抗体进行基因突变后筛选以提高其亲和力，但是因为没有对氨基酸位点功能进行详细的分析，所以突变位点的选择也存在一定的盲目性。因此，本文试图通过Blast序列比对为切入点，对纳米抗体PMP9G8的结构特点、功能位点、引物设计等方面进行分析。同时，选取专利CN200510024158.3.中的人源化EGFR单克隆重链抗体3C6序列(附录3)，与鼠源胚系基因进行比对分析，加深对于基因重排机理的了解。 图1.EGFR结构模式图 纳米抗体PMP9G8序列比对分析 将PMP9G8氨基酸序列输入BlastP搜索框中，搜索结果显示有12条高相似、全覆盖的氨基酸序列。名为Chain B, Nanobody/vhh Domain 9g8 In Complex With The Extracellular Region Of Egfr的序列能够与PMP9G8序列100%覆盖、且100%相似。这个序列能与EGFR胞外域结合形成复合体，由此可知纳米抗体PMP9G8也具有与EGFR结合的能力。VHH-9g8 domain序列中共有130个氨基酸，前127个与目的纳米抗体全部相同（图2），所以通过VHH-9g8 domain对序列进行分析，能够进一步了解纳米抗体PMP9G8的结构信息。 图2.纳米抗体PMP9G8序列比对分析结果 图3.纳米抗体 PMP9G8序列与VHH-9g8 domain序列比对结果 图4. VHH-9g8 domain序列信息 组氨酸标签 组氨酸标签 EGFR EGFR胞外域蛋白 VHH-9g8 domain与EGFR的结合位点 VHH-9g8 domain的N端 VHH-9g8 domain的C端 图5. VHH-9g8 domain与EGRF胞外域结合形成复合体的3D结构 VHH-9g8 domain序列来源为Lama，纳米抗体序列也是从Lama体内筛选得到的，两者同源。由图3可知，VHH-9g8 domain中含有8个β折叠（图中红框标注），蛋白的N端1-8号氨基酸为β折叠，纳米抗体序列C端对应的是VHH-9g8 domain的第127号位，不在β折叠区域内，为无规则卷曲的形状，比较自由。由3D结构（图4）可知，N端距离抗原结合位点比较近，所以在表达纯化加入组氨酸标签时不能够加在N端，否则容易影响抗体活性。如图显示VHH-9g8 domain的6个组氨酸标签也加在了C端上（图中绿框标注），所以在纳米抗体PMP9G8纯化时标签也应该加在C端以保证活性。 VHH-9g8 domain的第22位和第96位的两个半胱氨酸形成内部二硫键（图中蓝框标注），可以由此推测纳米抗体序列也在这两个位置上