地高辛中文操作说明.docVIP

所用试剂盒为Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，具体操作过程如下： 向一个反应管中加入1μg 模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μL； 沸水浴10min以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中；注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。 充分混合DIG-High Prime(1号管)，并取4μL加入到变性DNA中，混合并简单离心； 37℃孵育，过夜； 65℃加热10min，终止反应。 2）探针的纯化与回收 用PCR产物快速回收试剂盒（上海生工）回收标记好的探针，同时除去随机引物和未掺入的DIG-dUTP。具体操作步骤如下所示： ①在PCR反应液中加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀； ②8,000×g离心30秒。倒掉收集管中液体； ③加入500μl Wash Solution，9,000 × g 离心30秒，倒掉收集管中液体； ④重复步骤4一次； ⑤空柱于9,000 × g离心1分钟； ⑥将吸附柱放入一个干净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μl Elution Buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。 ⑦电泳检测探针的完整性，紫外分光光度法测定探针浓度，稀释到1 ng/μL 。 注：标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 3）检测探针标记的效率 直接标记法：将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（2号管）作为标准。 具体操作步骤：（注意在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜） 分别从你标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1 μL点在尼龙膜上； 通过120℃烘烤30min的方法将核酸固定在膜上； 将膜转移到一个装有20mL 马来酸缓冲液的塑料容器中，在15-25℃中振荡孵育2min； 在10mL 封阻液中孵育30min； 在10mL 抗体溶液中孵育30min； 用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min； 在10mL检测缓冲液中平衡2-5min； 将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上（或者杂交袋），向膜上加入2mL的新鲜配制的的底物显色液，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。保持膜静止，避光。15-25℃中孵育到有颜色出现为止。注意：可短时间打开看是否有斑点出现。 当出现斑点时，用50ml TE 缓冲液浸泡膜5min，用灭菌去离子水也可达到同样效果。将结果扫描或拍照保存。 所需试剂的配置 溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M马来酸 0.15M NaCl pH 7.5(20℃) 0.3%(v/v)Tween 2015-25℃,稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1M马来酸 0.15M NaCl 用NaOH(固体)调节pH值到7.5(20℃)15-25℃,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1M Tris-HCl 0.1M NaCl pH 9.5(20℃)15-25℃,稳定调整pH值到9.5TE缓冲液 10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH 8.015-25℃,稳定 终止显色反应  工作液的配置 溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1：10的比例将10×封阻液（6号管）稀释成1×工作溶液一直新鲜制备封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP(4号管)10000rpm离心5min。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：5000（150mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP2-8℃，12h与地高辛标记的探针结合底物显色液取40ul NBT/BCIP存储液（第5号管）加入到2ml 检测缓冲液中，注意：避光！ 一直新鲜制备 抗体结合点显色 注：5mol/L NaCl溶液【配制方法】在800ml水中溶解292.2g NaCl 加水定容至1L，分装后高压灭菌。 Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/lTris）【配制方法】在800ml 蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl 和3g Tris 碱，加入0.015g酚并用HCl 调至pH 值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034 ×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。 稀释系列 根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（2号管）应该稀释到1ng/μL。利用第3.3章中图表可以最好的