PCR、RT_PCR常见问题分析.pptVIP

PCR常见问题分析及解决方案;;;反应体系对PCR扩增的影响;如何选择最合适的DNA聚合酶;4 混合酶——高扩增效率＋高保真度;预配的PCR反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 ;PCR常见问题分析;PCR常见问题;问题1：无扩增产物;纯度：含有抑制物 浓度：含量低 质量：全长 结构：二级结构 ;引物错误 引物设计不好 引物降解 引物合成、纯化不好;退火温度 延伸时间 循环次数; ;引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多;提高PCR特异性的策略; ; ; ;甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等 可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当 ;RT-PCR简介;主要内容;;两步法与一步法RT-PCR比较; 分析基因的转录水平 获取目的基因 合成cDNA探针;逆转录酶的选择;RNase H的作用;提高RT-PCR特异性;RT常见问题;RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5’端不全 目的基因在组织中不 表达或表达量太低 ;PCR RT-PCR;PCR引物设计;引物的重要性;引物设计一般原则：长度;引物设计一般原则：结构;引物设计一般原则：错配;引物设计一般原则: GC含量;引物