第7章抗原抗体反应.ppt

; ppt课件制作及讲课 原则 自愿 有兴趣 组织方式 分组讲 选出最好在班上讲 内容 自选 数量 15张 分别折算 1 2 3次作业;上章小结： 一﹑基本概念 主要组织相容性复合物等 二﹑MHC抗原的结构和功能 MHC-I MHC-II结构、功能及两者与肽结合的区别 三﹑MHC抗原基因多态性及结构 四﹑MHC的检测原理和应用 ;第七章 抗原抗体反应及应用;一节﹑抗体的制备; 一﹑抗血清的制备及抗体纯化 1、抗血清的制备 抗血清：含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。;抗血清+3倍体积0℃ddH2O,调pH到7.7; 抗血清的初步纯化只是多数抗体类别的纯化。 上述冷酒精沉淀法是1946年Cohn创立的较好方法。该法得到的只是较粗Ig。 硫酸铵盐析法：比较简便，蛋白质变性小，33%饱和硫盐沉淀各类Ig，分离纯度较差。浓盐使IgA形成二聚体，不宜采用。 离子交换层析法：通过层析法，才能获得高纯度某一类Ig。;3、抗体进一步纯化 IgG在血清中含量最高，占75—80%，纯化的方法常用33-50%硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法。 IgG在pH7.5溶液中带正电荷，其它血清蛋白都带负电荷，因此可用阴离子交换剂DEAE-纤维素一次将IgG提纯到很高的纯度。 分离纯化IgM常用18%硫铵沉淀，再DEAE-纤维素柱层析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的IgM。 获得的纯化Ig，在4℃保存，长期保存需在-20℃以下。; 问题：血清中的抗体是由多个抗原决定簇刺激B细胞克隆而产生的抗体，是多克隆抗体(PAb)，通过分离的方法不可能获得真正的单一抗体。 如何获得大量的一种抗体？ 由单一B细胞克隆而产生的抗体，称单克隆抗体(MAb)。; 1 、制备MAb(monoclonal Ab,mAb)的原理 利用B细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。 用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产，称为杂交瘤技术。 该技术是1975年由G.K?hler Milstein创立的。;2、制备MAb的基本过程;返;用于制备B细胞的小鼠常用Balb/c品系，为H-2d单元(倍)??。 B细胞从小鼠的脾脏制取。 为保证B细胞有旺盛的分泌抗体活性，分离前3天一次静脉加强免疫。B细胞要悬浮于没有血清的培养液。 ? 骨髓瘤细胞有多种细胞株，营养缺陷型是一种。 缺陷是细胞缺少次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)，另一条核酸合成必须酶。当合成核酸的正常途径被阻断后（培养基中加入氨基喋呤），虽然培养基中有这二种底物(次黄嘌呤、胸腺嘧啶) ，但缺陷细胞仍不能合成核酸而死亡。 如果骨髓瘤细胞与B细胞发生了融合，因B细胞有正常的2套核酸合成酶系，正常途径受阻后，能利用培养基中的次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)来合成核酸，因此融合后的杂交瘤细胞能在选择培养基中正常分裂生长。 骨髓瘤细胞还应该具有不能合成抗体或合成了也不能分泌的特性 融合时，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，B细胞有旺盛的分泌抗体活性。 融合细胞按B细胞：骨髓瘤细胞＝5—10：1，总细胞数在107--108水平。 加入融合剂：50%的聚乙二醇(PEG)，37℃下融合1—2min。 然后用培养液RMPI1640进行洗涤稀释，去除PEG后，于HAT培养基上培养.; 筛选抗体分泌株：是将对HAT上形成的杂交瘤细胞集落进行抗体活性检测。 单克隆化：将多种细胞混合生长的细胞团分离为单克隆， HAT:即含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的选择培养基，简称HAT。 这种培养基能使杂交瘤细胞生长，而营养缺陷型的骨髓瘤细胞不能生长，B细胞因本身在培养基中不能生存。这样就能容易地将已经发生了融合的杂交瘤细胞筛选出来，其它细胞自然被淘汰。;三 抗体工程 四 催化性抗体 五 抗体在抗肿瘤治疗中的应用 ;二节﹑抗原抗体反应 一、抗原抗体反应的特点 ★抗原与抗体的特异性结合,既可以发生在体内,也可发生在体外。 发生在体外是许多免疫检测方法的基础。 ★抗原与抗体相互作用是非共价的、可逆的,其特性符合许多化学反应的基本原理. ; 特异性 抗原与抗体相互结合没有共价键形