人表皮生长因子的纯化及浓度在线检测.pdf

_______________________________________________________________________________ 人表皮生长因子的纯化及浓度在线检测 * * 童望宇 1, ， 姚善泾 2, ， 朱自强 2 （1 上海市华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海市 200237； 2 浙江省杭州市浙江大学化学工程与生物工程系，杭州 310027） 摘要 在分离纯化快速开拓系统（?KTA explorer 100）中用凝胶（Sephadex G-50 superfine）纯化人表 皮生长因子，并在优化条件下对其纯化过程中的 hEGF 进行定量测定。用标准人表皮生长因子经离子交换 柱、蛋白质扫描分析系统及 SDS间相互印证，结果表明：在优化条件下，可得到在 SDS上与 标准样品 hEGF 一样清晰的单条带，其产品纯度高于 94%，回收率高于 36%；其检测的灵敏度可达 1μg/ml。 该法不仅对人表皮生长因子的在线检测行之有效，而且对其它蛋白质纯化的在线检测也具有参考价值。 关键词 人表皮生长因子，层析，检测，纯化 中图分类号 TQ0333 Q819 引言 人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）是由 53 个氨基酸残基所组成 的多肽生长因子，分子量约为 6200D[1]。人表皮生长因子具有在体内刺激皮肤组织、角膜、 肺、气管上皮组织的生长繁殖及抑制胃酸分泌等多种生物学作用，因而可应用于外科伤口的 愈合及溃疡病的治疗等医疗领域[2-5]。自 1975 年 Cohen 等人[1]从尿液中首先分离纯化得到人 表皮生长因子以来，有关研究的进展很快，除了继续研究从天然来源中分离纯化以外，基于 基因工程菌发酵生产也已问世[6-7]，但是不管是从天然资源，还是来自基因工程菌发酵液， hEGF 的浓度总是偏低，需要经过较长时间的分离和纯化流程，才能得到相对较纯的产品。 为了设计一个高效和可控的纯化过程，hEGF 的在线分析和检测就成为非常重要。 目前，hEGF 的定量检测方法主要有放射免疫分析（Radio immuno-assay, RIA）[4]、放 射受体分析(Radio receptor assay, RRA) [8]、酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）[9]、酶免疫分析（Enzyme immunoassay, EIA）[10]、反相 HPLC[11]和免疫荧光 技术[12]等。以上各种方法均有其特点和不同的条件局限性，但均难用于过程的在线检测。 我们在使用 ?KTA explorer 100 进行蛋白质纯化时发现，该系统通过本身带有的软件， 不仅可以与各种层析柱结合进行多种生物质的分离流程研究，而且还可以比较精确地通过出 峰面积表示蛋白质量的多少。利用这种定量关系，就为定量确定生物质含量提供了基础。以 此为依据，对 hEGF 这个比较难于定量与分离的多肽，进行了凝胶层析中在线检测与纯化工 艺的优化，达到了纯化与在线定量检测的目的。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 联系人：童望宇，姚善泾， E-mail: tongwy@, yaosj@ 第一作者：童望宇，男，40 岁，博士