生物制药_第五章.pptVIP

2010年8月生物制药;内容;第五章 抗体工程制药;（1）抗体基本概念??;免疫反应;免疫分子（抗体，补体，细胞因子等） 免疫细胞 ：(淋巴细胞、粒细胞 及白细胞、浆细胞、肥大细胞等) 免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器 官 ； A\中枢器官是免疫细胞发生和分化的场所(胸腺--T、骨髓—成血干细胞和鸟类法氏囊---B) B\周围免疫器官是免疫细胞居住和发生场所:淋巴结、脾脏、黏膜相关的淋巴组织----分布于呼吸道、消化道\泌尿系统黏膜 ;Thymus;免疫系统与免疫细胞;;B细胞;T淋巴细胞;Tc细胞攻击肿瘤细胞扫描电镜像 (体外培养实验 人工加色);人T淋巴细胞攻击母细胞瘤细胞;T辅助细胞介导B细胞的激活;巨噬细胞的吞噬作用;中性粒细胞、血小板等;3、免疫因子：主要包括膜表面免疫因子和体液免疫因子。 B和T细胞表面有各自的特异性膜表面抗原受体BCR和TCR,能识别特异性抗原并与之结合，启动特异性免疫。 体液免疫因子主要包括抗体、补体和细胞因子。细胞因子是免疫细胞分泌的低分子的多肽，包括白细胞介素（IL）集落刺激因子（CSF）干扰素（INF）肿瘤坏死因子(TNF)及转化生长因子(TGF),具有多方面调节作用；既有细胞毒素和抗病毒功能，直接参与免疫应答的效应过程;（3）抗体的特性;抗体结合抗原的活性;抗体产生的规律;（4）抗体的基本结构和多样性;基因多样性决定抗体多样性;(5）抗体的分类;抗体的分类;(5）抗体的分类;抗体体内生成的理论;第二节 抗体工程研究; 抗体工程; 抗体工程;二、免疫方法 1.免疫的剂量：应考虑抗原性的强弱、分子量的大小、动物的状态和免疫时间。一般大:0.5－1mg/只，小:0.1－0.6mg/只。 2.免疫途径： 皮内或皮下免疫采用多点注射(8~10点)。皮内注射易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注射较困难(因佐剂加入后粘度大)；半抗原宜皮内多点注射。 用明矾作佐剂时，一般用于肌肉注射(因皮下注射易引起肉芽肿和脓肿)； 腹腔和静脉注射多用于颗粒性抗原和加强免疫。 对宝贵抗原，可采用淋巴结内直接注射抗原。;3.免疫时间： 首次和二次免疫之间要间隔约20 天，二次以后每次间隔7~10天。第一次免疫后，机体处于识别阶段，若很快第二次注入抗原，极易造成免疫耐受。第二次以后，若间隔时间过长，则刺激变弱，造成抗体效价不高。 三、动物采血法： 1.颈动脉采血法 2.心脏采血法（常用于小动物） 3.静脉多次采血法 ;四 抗血清的纯化、鉴定和保存;多克隆抗体缺点;2 单克隆抗体技术;杂交瘤技术的原理：动物细胞的融合技术;;; HAT培养基是在常用的细胞培养基内添加了3种特殊成分：次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)。 1.脾细胞：在体外5~7天内死亡，所以在HAT培养基中最终死亡。 2.骨髓瘤细胞：一般细胞合成DNA有两条途径：一条是主要途径，即由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，此途径可被氨基蝶呤(A)所阻止。 另一条是替代途径：在次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)存在下，由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)同时催化合成DNA 小鼠骨髓瘤细胞为HGPRT缺乏的缺陷型细胞，在HAT中，正常合成DNA的途径被氨基蝶呤(A)阻断，又因HGPRT缺乏而不能用替代途径，最终只能死亡。 3.杂交瘤细胞：合成DNA的途径阻断，但可利用原脾细胞的HGPRT完成替代途径的作用，存活。;HAT选择培养基选择杂交瘤细胞原理示意图;单克隆抗体McAb特点; ;1 单克隆抗体具有导向治疗作用;存在问题;3 基因工程抗体;1、获取目的基因 一般都是提取杂交瘤细胞系的mRNA经反转录PCR（RT－PCR）获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区（VH和VL）基因。 2、与合适载体连接在一起 根据将要表达的细胞来选择合适的表达载体，这些载体必须高效表达，对细胞本身无害，又带有选择标记。 3、基因工程抗体的表达 导入表达细胞，筛选阳性克隆后，按其目的不同，可选用原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不同表达方式进行表达。; A、原核细胞表达 融合表达－抗体末端附加一段其它肽段（如膜蛋白），作为标签，有利于对抗体文库进行淘筛，且有利于对克隆和抗体活性进行鉴定。（产物定位于细胞膜上） 分泌型表达－利用琥珀终止密码（TGA）的终止作用，在无琥珀抑制基因的菌株中进行表达，形成可溶性抗体。 ;B 真核细胞表达 用于表达基因工程抗体的真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞的表达都是分泌型表达。真核细胞表达抗体的方式在病