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DNA为基础的方法检测饲料中的动物源性成分 点击次数：39 发布时间：2011-2-16 以检测DNA为基础的方法主要有核酸探针杂交、DNA指纹分析、PCR-RFLP分析、PCR特异扩增(常规PCR方法和Real-time PCR方法)。其主要原理都是对各物种内特异的核酸序列进行提取、鉴定，从而判定饲料内有无该物种的成分，只是结果判别的信号条件不同。 核酸探针杂交方法的原理是碱基配对，即一条DNA链能与它的特异互补链配对形成双链DNA。因此，用一个荧光物质或放射性物质标记的单链核苷酸探针能够很快地从许多其他DNA分子的混合物中检测出它的互补单链。由于杂交探针需要用荧光物质或放射性物质进行标记，所以该法在实际检测中很少应用。 动物基因组中存在大量的分散重复序列(interspersedrepeat sequence，IRS)，并且是种间高度特异的，DNA指纹分析就是通过用哺乳动物中广泛存在的分散重复序列的特异引物进行PCR扩增，建立从牛到鸵鸟的30多种哺乳动物的DNA指纹图谱，来对饲料中的动物源性成分的DNA进行鉴定。由于DNA指纹有一定难度，所以该法在实际检测中也较少应用。 PCRRFLP(限制性内切酶多态性分析)方法是用引物进行扩增，然后对扩增片段用限制性内切进行酶切，利用限制性内切酶的多态性进行检测。由于使用的限制性内切酶对PCR产物进行限制性内切酶切分析不方便，所以该法在实际检测中应用较少。 PCR特异扩增方法由于其简单、快速、特异性强成为目前最广泛应用的方法，特别是荧光PCR(或称为Real-timePCR)的应用使得检测的特异性和敏感性更高。Tartaglia第一次设计了PCR试验，将其用于肉骨粉以及饲料中的反刍动物源性成分的检测。他所选的目标片断是线粒体DNA中编码tRNAlys和ATP合成酶8亚基和6亚基的片段，高等植物中未发现其同源序列，采用异硫氰酸胍和二氧化硅方法提取DNA，肉骨粉的检出的含量的最低限为0．125％，我国的出入境检验检疫系统根据该方法制定了检测肉骨粉中牛源性、羊源性成分的行业标准。 但是，随后对PCR方法的验证发现这一方法有其缺陷，因为加工过程中的热处理使得大量DNA被严重降解，分解成小片段，有数据表明当肉被加热到100~C时，其中的DNA就被降解到1100bp至300bp左右。若设计的目的片段???长则可能无法扩增出来，这在许多人的报道中被证实。因此，需要设计比较小的目的片段，同时要选择细胞内含量比较多的目标片段。目前所建立的PCR方法中以线粒体DNA中的细胞色素b与tRNAlysATP合成酶亚基8和亚基6的片段为目标区域的较多，线粒体基因的其他部分(如D—loop区域)，还有其他核酸序列(如卫星DNA、actln基因、SINEs序列和LINEs序列、生长素基因等)也被作为检测的目的基因。 线粒体编码的长度为60-70bp的片段已经被作为一些物种的目标片段进行检测，由于这些片段比较小，用琼脂糖电泳检测非常不方便，但用荧光PCR检测可以避免这些问题。Real—tmmPCR中使用的TaqMan技术是在引物的基础上又添加了一条探针，只有在探针与扩增出的目标片段结合时，才发出荧光信号，可以根据发出的荧光对反应进行实时检测，比经典的PCR方法特异性高，这是因为有引物和探针对目标进行双重筛选。有资料表明用这项技术对几种动物成分进行了检测，在所有样品中动物的成分都可清楚地检测到，这一结果说明，肉骨粉经过加工后，即使温度达到141~C，也有足够的DNA可通过Real—time PCR技术检测到，而当目标片段设计为275bp或350bp时，所有的样品都检测不到。同时对于目前的定性检测，利用不同的探针和染料可???做到一个反应内检测多个动物品种。 PCR方法在检测大多数生产条件下生产的饲料，至少在欧盟法定的条件下生产的肉骨粉是有效的，但生产过程的多样性导致了基因物质的不同降解水平，因此不同的生产条件都会对检测结果产生影响，扩增的片段大小也会对检测的灵敏度产生影响。PCR的缺点还表现在必须的刻防止交叉污染，并且这个方法无法检测动物DNA的来源，因为肉骨粉的出现与阳性信号的出现并无直接关系，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的来源。PCR方法相对来说是一种比较昂贵的方法，不仅试剂贵而且也需要比较昂贵的仪器，特别是荧光PCR仪