5.3血红蛋白的提取和分离 第2课时 学案 人教版选修一.doc

PAGE  5.3血红蛋白的提取和分离 第2课时 学案 人教版选修一 使用说明与学法指导 1.回顾上节课凝胶色谱法和电泳的原理。 2.掌握凝胶色谱法分离蛋白质的操作以及电泳操作过程。 知识准备 凝胶色谱法和电泳的原理 教材助读 蛋白质的提取和分离 蛋白质的提取分离一般分为四步： 、 、 、 。 样品处理 （1）红细胞的洗涤：洗涤的目的是： ，采集的血样药及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯中，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次直到 ，表面红细胞已洗干净。 （2）血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白 （3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的液体分4层，第1层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体是 ，第3层为红色透明液体这是 ，第4层为其他杂质的暗红色沉淀。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 （4）透析：取1ml血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300ml 20mmol/L 的 中，透析12h。透析可以去除样品中的 杂质或用于更换样品的 3、凝胶色谱操作 首先要制作 ；第二步是 ，因为 ，所以装柱前要根据色谱柱的体积计算所需要的凝胶量。在填充凝胶柱时，不得有 存在，避免降低分离效果；第三步是 。 血液的组成成分 水分 血浆 无机盐、葡萄糖等 血液 白细胞 血细胞 血小板 两个α-肽链 红细胞 血红蛋白 两个β-肽链 最多 四个亚铁红素基团 （二）实验操作 1.样品处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液。 试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 分离： 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 2.样品的粗分离 方法：透析 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内 目的：除去样品中分子量较小的杂质。 3.样品的纯化：通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 （1）凝胶色谱柱的制作： ①、取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②、底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③、顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④、组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤、安装其他附属结构 （2）凝胶色谱柱的装填 ①、凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②、凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③、凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④、洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7