种子制备与菌种保藏选编.ppt

第四章 种子制备与菌种保藏;生产菌种的必备条件： 1 生长快： 2 对环境条件要有比较大的承受能力 3 遗传表现型要稳定，不易退化 4 菌种要纯 ;斜面 沙土管 冷干管 液氮管;几个概念 种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。 发酵级数：种子罐的级数加一。 接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。 种龄：生产种子的培养时间。 ;一 斜面种子的制备 ;在无菌间超净工作台进行接种操作; 3. 质量检查 (1)??外观检查 ( 2)??无菌检查 ( 3)摇瓶生产能力检查 ; 4.影响斜面种子质量的因素;二 、米粒种子（米孢子） ;;4. 质量标准;四、摇瓶种子 1.摇瓶种子 : 将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。 2.制备流程 : 3.制备过程注意事项 培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。 培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上； 3) 灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上 4） 注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 5） 注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差 ;摇瓶种子制备流程;3.质量检查： ( 1)? 菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。 ( 2)??菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。 ( 3) 代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。 ( 4)??生产能力：摇瓶发酵试验。 ( 5)??污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查 4. 影响质量的因素 ;五、发酵罐种子 1.制备流程 ： ??????? 斜面、摇瓶或米粒种子 ↓ 培养基配制 → 实罐或连续灭菌 → 冷却 → 火圈或压力差接种 →培养→ 发酵罐种子 ;2 .制备过程注意事项 培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富， 控制培养基成份的合理配比， 2) 接种方式： 一级种子罐：火圈保护接种法和压差法 二级种子罐：压差法 3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50℃），搅拌转速也要适当。 4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵 5） 通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围 6）控制合适移种量： 确定合适的移种量：过大或过小都对发酵有不利影响 掌握种子罐的放罐体积。 移种方式： ;压差法接种操作示意;;种子罐1 发酵罐1 发酵罐2 种子罐2 1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种 ;3.质量检查及质量标准： 1）不污染杂菌 2）菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期， 菌体量未达到高峰 3）菌体浓度： 菌体浓度的测定方法：离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等 4）糖、氮、磷代谢情况 5）种子液pH 6）摇瓶试验的发酵水平 7）特异性酶活力 ;种龄对发酵的影响;种子液的 pH值反映种子的状态;4 影响质量的因素 5 种子代谢缓慢原因分析 空气温度偏低 局部烫伤 培养基原材料质量差 培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多 无机磷量低 接种量太小 前一级种子质量太差 泡沫多通气差 ;第二节菌种保藏 （strain conservation);中国微生物菌种保藏中心 ;American Type Culture Collection (ATCC), United States of America. National Collection of Type Cultures (NCTC), United Kingdom. Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan. ;二、常用的菌种保藏方法 1 单纯传代保存法（斜面或穿刺） 4℃冰箱或15℃室温，保存期3-6个月 适用于细菌或酵母 2 结合单孢子分离的传代保存法 斜面→孢子悬浮液→稀释涂布→单细胞分离培养 →挑菌→高产菌株