2011.3.3原生质体制备及转化.pptVIP

文献汇报;培养基成分;《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）;1、原生质体混合、PEG助融 2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合，导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养;《工业微生物育种学》 施巧琴 吴松刚;*缓冲液：pH5.8-6.8磷酸氢二钠-柠檬酸溶液 *高渗溶液：0.6mol/L NaCl溶液 *酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽滤除菌;取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样观察。 （该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对菌丝的伤害和杂菌污染） 酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次，用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液1500-2000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。 双层平板，再生，计算原生质体再生率。;林艳学姐：;以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中;将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min； 弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞/mL； 将约2~5μg质粒DNA(体积不超过10μL)与100μL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀； 加入25μL PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室温放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混匀。;菌丝培养基 葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。;混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃ ;1. 米曲霉C-2在2% G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL 0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养23~25h； 2. 过滤收集菌体，用无菌水与0.8M NaCl各洗涤一次； 3. 菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml 酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mM DTT）； 4. 置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况； 5. 酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体； 6. 用0.8M NaCl洗涤二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗涤一次； 7. 弃上清原生质体重悬于100μL 0.8M NaCl-50mM CaCl2中，血球板计数。;1、将构建的pMD-pyrG质粒与100μL原生质体置冰上轻轻混匀； 加入25μL预冷PTC，冰浴30 min； 2、再加入500μL上述PTC溶液，平静混匀，室温20min； 加入预冷1mL 0.8M NaCl-50mM CaCl2 ，混匀； 3、与100mL米曲霉高渗再生培养基混合，倒平板； 30℃培养4-7天。;培养基成分;取培养20h的康氏木霉菌丝体悬液10mL，4000r/min离心30min收集菌丝体，用无菌水4000r/min离心30min洗涤2次，加2.0%蜗牛酶溶液30℃水浴酶解至原生质体形成率接近100%时停止酶解，用0.6mol/L NaCl 5min条件下离心洗涤2次，最后将原生质体悬于0.6mol/L NaCl溶液中。;取原生质体悬液1mL与5mL上层再生培养基混匀，倾倒于下层再生培养基平板上，待培养基凝固后于28℃培养箱中倒置培养。用下式计算再生率： 再生率（%）=（A-B）/C×100% 式中：A为经高渗溶液稀释的原生质体在再生培养基???长出的菌落数；B为经无菌水稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数；C为显微镜下计数的原生质体数。;培养时间;原生质体再生;菌丝体培养60 h,用1. 5%溶菌酶+ 0. 5%蜗牛酶混合酶液, pH值6. 0～6. 5,温度30～35 ℃,酶解4 h,以0. 7mol/L甘露醇为稳渗剂,此条件下原生质体产量可达1. 68 ×107 个/ml。;Click to edit company slogan .