蛋白样本制备与WB.pdfVIP

蛋白样本制备蛋白样本制备 与与Western Blot 主要内容主要内容 一 蛋白样本制备的目的与重要性 二 蛋白样本制备的总体策略和原则 三 案例分析—细胞总蛋白的提取 1 细胞裂解液配方分析与技术要点 2 表面活性剂的选择 3 蛋白酶抑制剂与其”鸡尾酒” 4 磷酸酶抑制剂 四 蛋白提取产品选择指南 1 核蛋白与转录因子EMSA分析 2 膜蛋白提取 3 多种蛋白的分级提取 五 蛋白定量方法的选择 六 成功的 Western Blot 1 WB原理与方法 2 WB的成功要素 3 常见问题分析与解决方法 一一 蛋白样本制备蛋白样本制备成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础 1 蛋白样本制备的目的: 后续应用于: ? activity assays ? protein microarrays ? SDS/IEF ? immunoblotting(Western Blotting) ? ELISA ? EMSA(gel shift) ? two-dimensional gel electrophoresis(2D), ? mass spectrometry 2 蛋白样本制备的重要性: 蛋白样本制备是蛋白试验的第一步,更是最重要的步骤!是决定试验成败的关键! 但却往往是最容易被忽视的步骤! 误解1:认为简单 误解2:方法单一 细胞内蛋白质的复杂性细胞内蛋白质的复杂性 ? 种类多:数千种,并且是混合物(与核酸多糖脂质小分子混一 起) ? 分子大小分布范围宽:几百个至上万氨基酸,多数为1万-- 15万道尔顿 ? 含量不均:某种可能占总蛋白的10%,有些只占0.001%以 下 ? 性质多样:正电或负电荷\极性或非极性\亲水或疏水,二级 结构或空间结构形成大小形状残基分布等均不同的分子 二二 蛋白样本制备的原则蛋白样本制备的原则 ? 方法应具备标准化方法应具备标准化 具有重现性具有重现性 可靠性和简便性可靠性和简便性 ? 尽尽量抽提完全量抽提完全 ? 应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白）白） ? 防止发生蛋白的降解防止发生蛋白的降解 聚集聚集 沉淀沉淀 变性变性 ? 防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降 解等）解等） ? 如做如做2D2D则需去除高丰度蛋白则需去除高丰度蛋白或无关蛋白或无关蛋白 ? 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 二二 蛋白样本制备的策略蛋白样本制备的策略 ? 制备蛋白的目的 活性分析 免疫印迹杂交(WESTERN BLOTTING) 免疫沉淀或共沉淀 (IP 或 CO-IP )1D 2D EMSA CHIP等 ? 实验材料 细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后的 剩余的蛋白样本等 ? 目的蛋白的结构 性质与分布 分布于胞桨/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四级结构 特征 磷酸化等修饰…… ? 方法的选择 1 自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取(案例分析与技术要点) 2 购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取(产品选择指南) 三三 案例分析案例分析 细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备 ? 细胞加入细胞加入裂解液裂解液轻摇轻摇1515--3030分钟分钟 ? 离心收集上清即得全蛋白样本离心收集上清即得全蛋白样本 ? 蛋白定量和蛋白定量和SDSSDSPAGE检测检测 细节决定成败! 11 细胞裂解液细胞裂解液--RIPARIPA BufferBuffer的配方分析和技术要点的配方分析和技术要点 22 表面活性剂分类及作用原理表面活性剂分类及作用原理 结构:两性分子,亲水的头和疏水的长尾 作用: 溶解膜与膜脂 溶解与稳定蛋白质(特别是膜蛋白) 作为蛋白质的变性剂 作用原理: 1 去垢剂单体分配入膜扰乱膜结构,造成膜裂解