磁性可再生性固定化酶制备及其在微波辅助蛋白酶解中的应用.pdfVIP

第 ３４卷 第 ４期 桂 林 理 工 大 学 学 报 Ｖｏｌ３４Ｎｏ４ ２０１４年 １１月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｕｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏｖ　２０１４  文章编号：１６７４－９０５７（２０１４）０４－０７４８－０７ ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ１６７４－９０５７２０１４０４０２５ 磁性可再生性固定化酶制备及其在 微波辅助蛋白酶解中的应用 韦美苹，庞玉凤，陈正毅，苏日辉，杜甫佑，阮贵华 （桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林　５４１００４） 摘　要：将磁性可再生性固定化酶应用于微波辅助蛋白酶解。包覆了 ＳｉＯ２ 的 Ｆｅ３Ｏ４ 磁性粒子（Ｆｅ３Ｏ４＠ ｍＳｉＯ２）表面经 ３（２，３环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷偶联剂（ＧＬＹＭＯ）与亚氨基二乙酸（ＩＤＡ）反应的产物 （ＧＬＹＭＯＩＤＡ）修饰，加入 Ｃｕ２＋形成金属螯合配体后利用 Ｃｕ２＋与木瓜蛋白酶作用固定木瓜蛋白酶。在优化 条件下，获得的固定化酶酶活为 １１５８８Ｕ，酶活保留率达 ４４１％。所获得的固定化木瓜蛋白酶具有易再 生、再生后酶活稳定的特点。再生 ５次后酶活平均值为 １０１４Ｕ，再生率达 ８８％。ＨＰＬＣ分析表明，微波辅 助结合固定化可再生酶可用于黑蚂蚁蛋白的快速酶解，获得的色谱图轮廓与自由酶酶解结果相似。酶解过 程快，多肽丰富且易与底物分离，表明可再生固定化酶结合微波辅助有助于蛋白的酶解与多肽的制备。 关键词：磁性粒子；固定化酶；木瓜蛋白酶；黑蚂蚁蛋白 中图分类号：Ｑ８１４２　　　 　 　　　　　　　　　　文献标志码：Ａ 近年来多肽研究受到人们的重视。多肽作为 溶液中进行［９－１０］，但基于溶液中的蛋白酶解存在 一组重要的化合物，在生理学过程、分子生物学 一些问题，如酶解时间长、酶自身降解及失活、 和临床研究中扮演着重要的角色［１］。生物活性肽 酶解产物与酶及底物难以分离、样品易受污染和 是指具有调节生物体生理功能的多肽。目前，已 不利于自动化在线快速酶解等［１１－１４］。蛋白酶固定 有很多关于各种生物多肽活性研究的文献报道， 化技术［１５－１８］实现了酶与样品的易于分离，使得酶 如镇静、抗血栓和抗高血压活性等［２－４］。生物活 可以回收和重复利用，避免了自由酶酶解过程中 性肽多通 过 基 因 改 造、基 因 重 组 或 者 合 成 法 制 酶灭活对产物带来的影响。此外，与溶液中的蛋 备［２］，但这些方法的成本非常昂贵，不利于大规 白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶 ／底 模生产［３］。一般地，具有一定氨基酸序列的生物 物比、更高的酶解效率、更短的酶解时间、可重 活性肽以母蛋白存在时通常不显示出活性，但通 复使用并能减少酶的自身降解等优点，但固定化 过酶解母蛋白的方式可将其释放［４］。蛋白质水解 酶经过多次使用或长期存储后酶活有所下降。近 法是一种简单、廉价的多肽制备方法，将蛋白转 年来出现的可再生酶固定化酶反应器可弥补这一 换为短链肽后比原来的蛋白质更易溶于水，且氨 缺陷，并且已被成功应用于蛋白质组学的研究［１９］。 基酸组成基本保持不变［５－７］。 微波可加速酶解反应［２０－