ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的论文.docVIP

　　ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的论文 【摘要】 目的 检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力，探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法 采用逆转录聚合酶链反应（rt pcr）及rna和蛋白表达水平；采用pcr法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pglbhe(-1444/+134)；采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在ec109、hela、a549和bgc823细胞中的转录活力。结果 ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达，其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论 ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。 【关键词】 逆转录聚合酶链反应 (ezrinradixinmoesin)家族成员之一, 主要参与细胞骨架与胞膜之间的连接 [1]。研究证明，ezrin基因在食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌以及其他多种肿瘤细胞中过表达[26]。.分析ezrin基因的外显子、内含子以及转录起始位点上游3 000 bp以内的dna序列，结果发现，ezrin基因转录起始位点上游约1 600 bp的范围为高gc含量区，存在cpg岛，且含有转录因子sp1的众多潜在结合位点。然而，ezrin基因在肿瘤细胞中的表达是否受到cpg岛甲基化或转录因子sp1的调控，调控位点又在哪里？这些问题迄今仍不明确。本研究对我们实验室现有的几种癌细胞进行ezrin基因表达检测，同时克隆ezrin基因5′侧翼高gc含量区序列，检测此序列在癌细胞中的转录活力，为进一步揭示ezrin基因在癌细胞中的表达调控机制奠定基础。 1 材料与方法 1.1 质粒、细胞系及主要试剂 质粒pgl3basic (pglb)、pgl3promoter (pglp)和prltk购自promega公司。 食管癌sheec细胞株为本实验室建立[7]，其余细胞株购自中国科学院细胞库。 trizol试剂、199培养基、dmem培养基购自invitrogen公司；限制性内切酶、逆转录系统试剂盒、pcr mix、双荧光素酶报告基因分析系统购自promega公司；pvdf膜购自millipore公司；ezrin ab1（3c12）购自neo markers公司；βactin抗体（ac15）购自sigma公司；标准蛋白分子量（sc2035）、羊抗鼠igghrp（sc2031）、化学发光试剂购自santa cruz公司。superfect转染试剂、质粒提取试剂盒购自qiagen公司。其他常用试剂为国产分析纯试剂。 1.2 细胞培养 所有细胞均置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。ec109（食管癌）、ec171（食管癌）、ec8712（食管癌）、sheec（食管癌）、bgc823（胃癌）、hela（宫颈癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的199培养液中；n87（胃癌）、a549（肺癌）、95d（肺癌）、hepg2（肝癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的dmem培养液中。贴壁细胞培养成单层后，用0.25%胰蛋白酶（含0.02% edta）消化，传代培养，待达到一定数目[（1～2)×107]后收获细胞。k562（髓性白血病细胞株）细胞悬浮生长于含10%灭活小牛血清的rpmi199培养液中，细胞密度保持在(0.1～0.5)×106 cells/ml，每3天传代一次，当密度达到(1.0～1.5)×106 cells/ml时收获细胞。 需要进行瞬时转染实验的细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，细胞接种密度为2×105 cells/ml。细胞置37℃培养，细胞满度约为50%～60％时，转染质粒。 1.3 逆转录聚合酶链反应（rt pcr） trizol试剂提取细胞总rna，经逆转录获得cdna。扩增ezrin基因部分序列的上、下游引物分别为5′cgggcgctctaagggttct3′和5′tttcggtttctggtgagtatcctcgatccc3′，扩增片段位于ezrin基因的+30/+134（转录起始位点定义为+1）。扩增gapdh基因的上下游引物分别为5′gaaggtgaaggtcggagtc3′和5′gaagatggtgatgggatttc3′，扩增片断位于gapdh基因的+108/+333（转录起始位点定义为+1）。将两对引物放入同一pcr反应体系，反应条件如下：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；72℃ 5min。扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，于f