植物花药培养及单倍体植株鉴定-2015.ppt

植物花药培养及单倍体植株鉴定;花药培养：是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。属于器官培养。;一、实验目的与原理;花药培养基本流程：;二、实验内容 1、镜检花粉发育时期 2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养 3、单倍体植株的鉴定;三、实验器材 材料：烟草花药。 试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、蒸馏水。 仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。;四、实验步骤 1.适期花药的选择;一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。;四分体时期;四分体: 醋酸洋红染色;单核晚期;处于不同发育阶段的烟草花芽 ;不同???种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期;2.花药离体培养;花药培养过程; ① 预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。;② 培养基 ;高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。 铁盐对花粉胚状体发育很重要。 活性炭促进胚状体发育。 较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。 细胞分裂素可促进胚状体形成； 生长素可诱导愈伤组织形成。 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。 氨基酸 有机附加物;类别;类别;激素;③ 培养条件 ;1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。 ;单倍体植株的发育方式;胚状体发育途径;A：从裂开的花药中长出胚状体; B、C：从药室中直接长出的幼苗; D、E：具有根、茎、叶的小苗; F：小苗发达的根系;愈伤组织发育途径;⑤ 白化苗现象;（一）白化苗产生的影响因素及机理 1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。 2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。 （二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。 ;3.单倍体植株的鉴定 通过花药培养获得的再生植株的染色体数目也常发生变异，其后代常是混倍体，所以必须对其后代进行鉴定。 鉴定方法既可以根据形态特征进行间接鉴定，也可以镜检体细胞中的染色体数或花粉母细胞中染色体数以及染色体配对的情况进行直接鉴定。此外还可以根据花粉的育性或利用遗传标记性状进行鉴定。 （1）染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织用醋酸洋红染色进行制片，直接计数染色体数目。 ;（2）间接鉴定 （1）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫??胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 （3）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性。 （4）杂交鉴定法 自交或测交鉴定 根据后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）。 ;醋酸洋红染色法观察植物根尖细胞染色体 ;四、注意事项 1. 提高诱导效率。 2. 降低白化苗的发生频率。 五、作业与思考题 1. 花药培养的一般程序； 附培养结果（照片） 2. 影响花药培养的因素； 诱导率/ %=(愈伤组织数/接种花药数)×100 出苗率/ %=(花药出苗数/接种花药数)×100 3. 单倍体植株的鉴定方法； 4. 单倍体育种的意义和不足之处。;胚状体形成： MS培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 0.2mg/L + 6-BA 2mg/L + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）;胚状体形成： H培养基（基本成分）+ NAA 0.2mg/L + 6-BA 2mg/L + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）