动物肝组织中丙二醛含量测定方法的改进的论文.docVIP

　　动物肝组织中丙二醛含量测定方法的改进的论文 【摘要】 目的初步探讨糖类物质对肝组织中丙二醛（mda）含量测定的干扰并改进测定方法。方法该实验以含糖量不同的小鼠肝匀浆作为实验材料，通过葡萄糖在450nm和532nm处吸光度值的正相关关系建立直线回归方程，校正mda在532nm处的吸光度值。计算出样品中mda含量。结果肝组织中糖类物质会干扰mda含量的测定，尤其是当样品中糖量含量间差异较大时，糖的干扰可能导致对机体受损程度的错误评判。结论改进后的方法更为科学、准确，可应用于动物肝组织丙二醛含量的测定。 【关键词】 丙二醛； 灵芝多糖； 葡萄糖； 直线回归法 丙二醛（malomdialdehvde，mda）是机体内的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形成的脂质过氧化物，测试mda的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度［1］。传统的测定方法是利用过氧化降解产物中的丙二醛与硫代巴比妥酸（tba）在高温和酸性条件下缩合，形成的红色产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）于532nm处有最大吸收峰来进行测定的。这种方式常常受到多种物质不同程度的干扰［2］。其中最主要的干扰因素是组织内的可溶性糖。动物肝组织中含有大量的肝糖原，在测定时降解的葡萄糖会干扰测定。.而探讨动物组织中糖类物质对mda测定的干扰及消除方法还未见报道。本研究以含糖量不同的小鼠肝匀浆作为实验材料，初步探讨了葡萄糖对肝组织中mda含量的测定的干扰并改进了测定方法。 　　1 材料 　　1.1 动物清洁级昆明种雄性小鼠，18～20 g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物研究中心提供。动物饲养室温度为22～25 ℃，湿度为65%～80%。 　　1.2 试剂丙二醛（mda）测定试剂盒，购于南京建成工程研究所。其它化学试剂均为分析醇。 　　1.3 仪器752型紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；飞鸽牌tgl-16c离心机（上海安亭科学仪器厂）；解剖剪。 　　2 方法 　　2.1 动物分组及给药清洁级昆明雄性小鼠48只，体质量18～20 g。参照文献［3］的方法，将实验动物按体重随机等数分为4组，即对照组（control group，cg）、多糖高剂量组（high-dose group，hg）、多糖中剂量组(medial-dose group，mg)、多糖低剂量组（lol/d生理盐水灌胃，其余3组以0.3 ml/d不同浓度的灵芝多糖溶液灌胃，多糖高、中、低剂量的服用量分别为200，100，50 mg/(kg·d)。实验期间小鼠自由摄食及饮水，每5天称量1次体重，根据体重调整灌胃量，连续灌胃30 d。 　　2.2 灵芝多糖的制备实验室固体发酵所得灵芝菌丝体100 g加入7 l蒸馏水，85 ℃水提50 min。过滤所得的上清用旋转蒸发仪浓缩到0.1 l后，加入0.1 l无水乙醇4 ℃过夜沉淀，4 000 r/min离心20 min后取沉淀用适量蒸馏水溶解，冷冻干燥得到的褐色粉末为灵芝粗多糖。 　　2.3 肝匀浆的制备动物禁食过夜，次日颈椎脱臼处死、开胸、剖开腹腔。用4℃生理盐水清洗肝脏，用滤纸吸干肝表面水分，称肝重，加20倍干重的0.05 mol/l pbs缓冲液在匀浆机内匀浆，即制成5%肝匀浆。所有操作均在冰浴中进行。 　　2.4 小鼠肝组织糖类物质含量的测定小鼠肝组织糖类物质含量利用苯酚硫酸法［4］进行测定。 　　2.5 葡萄糖对tba反应的影响测定 　　2.5.1 葡萄糖与tba反应的比色测定 　　因为肝组织存在较多的糖原，其在一定条件下可降解为葡萄糖，所以本实验以葡萄糖为标准探讨排除糖类物质对mda-tba反应干扰的情况。参照mda测定试剂盒的测定方法，取200 μl 50 mg/ml葡萄糖溶液，加入0.6%tba（50%冰醋酸溶解配制）3.2 ml，沸水浴80 min后4 000 r/min离心10 min，取上清液经752型紫外光栅分光光度计400～700 nm扫描并记录结果。 　　2.5.2 mda测定条件对样品中肝糖原降解情况的影响 　　取0.5 ml 5%肝匀浆上清液，加入1.5 ml 50%冰醋酸后沸水浴20～80 min，并设置对照组：取0.5 ml 5%肝匀浆上清液，加入1.5 ml蒸馏水。将各组反应液ph调至7.0后，加入2 ml dns溶液煮沸5min后［5］测定各样品在540 nm处吸收值的变化。 　　2.5.3 mda-tba反应中糖类物质干扰的排除(直线回归法) 　　取不同浓度（0～50 mg/ml）的葡萄糖溶液，按照丙二醛（mda）测定试剂盒上的说明，加入0.6%tba（50%冰醋酸溶解配制）3.2 ml，置沸水于中80 min后4 000 r/min离心5min后，测定上清液在450 nm和532 n