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第4章 固定化酶和固定化细胞;第4章 固定化酶和固定化细胞 （2学时）;本章主要介绍了固定化技术的发展史、酶和细胞的固定化方法以及酶经固定化后性质的变化，从动力学方面分析了固定化后酶特性变化的原因，并简要介绍了酶反应器的结构特点。;固定化酶、固定化细胞是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束的酶、细胞。近代工业化利用始于1969年固定化氨基酰化酶的应用。利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展 。其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。;4.1 固定化酶的定义与优点;固定化酶的优点：;4.2 酶固定化技术发展史 ;将酶固定化以后，既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，使其具有一般化学催化剂能回收反复使用的优点，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化。事实上，早在1916年，Nelson和Griffin就用吸附的方法实现了酶的固定化，他们将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，发现吸附以后酶不溶于水而且具有和液体酶同样的活性，可惜这个重要的发现长期以来没有得到酶学家的重视。 ;系统地进行酶的固定化研究则是从20世纪50年代开始的。1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、羧肽酶、、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶与这种载体结合，制成了固定化酶。六十年代后期，酶固定化技术迅速发展，出现了很多新的酶固定化方法。1969年，日本的著名学者千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分上，来生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例。;在20世纪60年代后期对酶的固定化研究主要是将酶与水不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以最初曾称为水不溶酶（water insoluble enzyme）和固相酶（solid phase enzyme）。但是随着理论与技术的发展，后来发现也可以将溶解状态的酶固定在一个有限的空间使其不能自由移动，也能达到固定酶的作用。如把酶包埋在凝胶内，酶本身是可溶的，因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。所以在1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme。;用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，后来随着固定化技术的发展，作为固定化的对象已不一定是酶，也可对含酶细胞或细胞器进行固定化。1973年，日本的千畑一郎等成功的使用固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸，将固定化微生物细胞首次应用于工业生产，使细胞固定化技术迅速发展1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。;目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大潜力。但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。;4.3固定化酶的制备方法;在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。 （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。;这就要求酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应；另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。 ;（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。 （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。;（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。;酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。吸附法和