一节引言.pptVIP

第一节引言;一、分离纯化的意义;二、分离纯化的要求;三、分离纯化的一般程序;第二节 蛋白质（酶）、核酸 分离纯化的前处理;二、细胞的破碎;组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 ;三、细胞器的分离;四、提取;1、蛋白质（酶）的提取;2、核酸的提取;蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。 去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。 有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。 ;第三节 分离纯化;一、蛋白质（酶）的分离纯化;;（1）盐析; 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：;常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。 ;（2）等电点沉淀;（3）有机溶剂法; 室温下，这些??机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 ;2、细分级分离;3、酶的活力测定;二、核酸的分离纯化;核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。 超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。 电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。 柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。;第三节 纯度鉴定;核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。