结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin的作用的论文.docVIP

　　结肠癌细胞内吞活动中癌基因产物cortactin的作用的论文 【摘要】 目的 探讨癌基因ems1表达产物皮层蛋白(cortactin)与结肠癌细胞内吞运动的关系。方法采用共聚焦显微镜检测人结肠癌细胞株ht29细胞内cortactin与内吞过程功能蛋白rab5及rab11的分布情况，以及cortactin和组成性内吞标记转铁蛋白(tfn)的关系。采用病毒转染的方法，将外源性全长cortactin及其突变体转入结肠癌细胞内，观察过表达皮层蛋白及其变异体对细胞内吞活动的影响。进一步采用s1的表达产物cortactin（皮层蛋白）对细胞内吞活动的实现起关键作用 [6] ，但该分子在结肠癌细胞内吞活动中的作用如何尚未见研究报道。本实验通过分析结肠癌细胞中皮层蛋白与癌细胞内吞的关系，发现cortactin的表达影响结肠癌细胞的内吞活动。cortactin的氨基端和羧基端对于cortactin在内吞过程中发挥功能起关键作用。同时发现cortactin在结肠癌细胞的内吞过程中???生磷酸化。本文对此作首次报道。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株 选用人结肠癌细胞株ht29 (来自atcc)。 　　1.1.2 抗体和试剂 一抗兔抗人cortactin单克隆抗体（美国upstate公司），鼠抗人rab5/11单克隆抗体（美国sigma公司）。罗丹明标记的马抗兔、荧光素标记的马抗鼠及抗转铁蛋白（tfn）抗体（购自美国sigma公司），cortactin磷酸化多克隆抗体（由美国马里兰大学x.zhan实验室制备）。elisa试剂盒（美国sigma公司）。细胞转染试剂lipofectamine2000购自美国invitrogen公司。 　　1.1.3 重组质粒 以人全长cortactin cdna为模板设计引物并作pcr，将全长cortactin cdna、氨基端1～80aa缺失及羧基端sh3缺失片段分别克隆到逆转录病毒载体mgin，构建重组质粒。重组质粒由美国马里兰大学zhan试验室惠赠。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞株ht29以10％小牛血清的rpmi 1640培养液，在37℃、5 ％co2条件下常规培养。取对数生长期细胞进行实验。 　　1.2.2 共聚焦显微镜检测 结肠癌细胞接种于放置盖玻片的6孔板内，应用完全培养基培养过夜。次日以磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤细胞1次，以4％多聚甲醛在室温下固定30min，滴加一抗作用, 4℃过夜，次日用pbs洗涤细胞3次，应用荧光标记的二抗在室温下作用2h，再以pbs洗涤3次，缓冲甘油封片，至共聚焦显微镜下观察。 　　1.2.3 细胞蛋白提取与mol／l tris．hcl、100mmol／l nacl、2mmol／l edta、1％ sds与蛋白酶抑制剂)。将细胞裂解液作变性聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，以5％ 的脱脂奶粉封闭(20mmol／l trissup2;hcl、150mmol／l nacl和0.1％ tine2000混合转染gpg293包装细胞，并在转染后24～72 h收集病毒上清液，将病毒上清感染ht29细胞并用g418筛选，获得稳定表达重组质粒的细胞株。 　　1.2.5 elisa测定 将细胞以1%bsa的无血清1640培养基，在37℃、5％co2培养箱中培养30min,然后加入生物素标记的转铁蛋白（biosup2;tfn）置于冰上30min。然后将细胞置于37℃ 5min，置于冰上终止细胞内吞活动。用封闭缓冲液（1%bsa，1%tritonxsup2;100，10mm trissup2;hcl,ph7.5,0.1% sds,1mm edta,50mm nacl）将细胞裂解，再将细胞裂解物加到包被有抗sup2;tfn抗体的96孔elisa板上，4℃孵育12h，每孔中加入hrp标记二抗作用1h，加入显色剂，最后检测od450值。 　　1.2.6 统计学方法 　　采用stata7.0软件，作方差分析， p＜0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 结肠癌细胞内cortactin与rab5和rab11及内吞的转铁蛋白颗粒的定位关系 　　rab蛋白家族是调控真核细胞囊泡运输的主要蛋白质，rab5主要负责调控细胞内吞过程中胞吞泡与初级内体的融合，rab11主要定位于循环内体。我们在共聚焦显微镜下观察发现：结肠癌细胞内cortactin呈彗星尾状（红色）与rab5/11蛋白（绿色）相互关联，见图1。同样，在吞噬fitc标记的tfn的结肠癌细胞内，cortactin呈彗星尾状与tfn发生共定位，见图2。 　　2.2 癌细胞过表达外源性cortactin及其变异体对tfn内吞的影响 　　cortactin分子