实验13_琼脂糖凝胶电泳的原理和方法.ppt

;一、电泳方法的分类 ;按支持物的装置形式不同，区带电泳可为： 平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式； 垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳； 垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类； 连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。;概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。; 天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。; 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 ; 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 ;琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 (4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。; 目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出。 ; 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 ;1.核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系 (1)DNA分子的大小： DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。; 在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ;(2)琼脂糖的浓度： 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示: ;2. 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalently closed circular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以 长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 ; 3. 电泳方法 (1)凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。 ;(2)缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 ，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉 淀，