His标签单克隆抗体的制备、 鉴定及初步的论文.docVIP

　　His标签单克隆抗体的制备、 鉴定及初步的论文 摘要】 　　目的: 制备和鉴定抗his标签单克隆抗体（mab）, 初步建立检测和纯化带his标签融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亚胺法合成his-tag完全抗原, 免疫balb/c小鼠, 采用杂交瘤技术进行细胞融合, 通过有限稀释法和间接elisa法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水, 用辛酸-硫酸铵法纯化, 并对纯化的mab进行特异性鉴定。结果: his-tag完全抗原偶联成功, 经细胞融合、 筛选及克隆化, 成功获得1株分泌his标签mab的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于 1∶106, 且此株mab与其他融合蛋白标签无交*反应, 并在含his标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论: 成功制备了1株his标签mab, 为带his标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。 【关键词】 his标签 单克隆抗体 蛋白印迹 　　his-tag是由6个组氨酸(his-his-his-his-his-his)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化, his-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势, 是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用 his标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。目前商品化his-tag的单克隆抗体(mab)种类不多, 且价格也十分昂贵。因此, 研制出 his-tag的mab, 在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。.cOm 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 his六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白 (ova)、 牛血清白蛋白（bsa）、 兔抗小鼠 iga、 igg1、 igg2a、 igg2b、 igg3和igm抗体均购自sigma公司; hrp标记的羊抗鼠 igg由河南省生物工程技术研究中心提供; multiskan mk3酶标仪购自thermo公司; 3326型co2培养箱购自forma公司; 硝酸纤维素膜（nc膜）购自amersham公司; sds电泳仪购自bio-rad公司; balb/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周, 体质量18～22 g）购自中国医学科学院动物研究所。 　　1.2 方法 　　1.2.1 人工抗原的合成 （1）免疫原的合成: 称取4.4 mg his-tag和5 mg ova溶于1 ml pb（0.05 mol/l, ph7.0）中, 充分溶解后, 将200 μl含有2.2 mg edc的pb溶液逐滴加入, 边滴入边混匀, 摇床100 r/min反应4 h, 4℃静置过夜, 用 0.01 mol/l, ph7.0 pbs透析 72 h, 存储于-20℃备用。（2）包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成,载体蛋???为 bsa。 　　1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 按本室常规方法免疫balb/c小鼠（20～30 μg /只）, 末次免疫后免疫小鼠血清效价达到 1∶10 000以上, 进行细胞融合, 并以间接elisa法筛选分泌抗 his-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备, 均按实验室常规方法进行。 　　1.2.3 mab特性鉴定 （1）效价测定: 以 bsa-his-tag（100 ng/孔）包被 elisa 板, 腹水从 1∶10 00 开始作10倍稀释。用间接 elisa法进行测定。（2）mab特异性鉴定: 用于抗体交*反应性研究的为常用蛋白标签, c-myc、 多聚精氨酸、 flag、 钙调蛋白结合多肽、 β-actin、 谷胱甘肽s转移酶 (gst)、 葡萄球菌蛋白a(spa)、 麦芽糖结合蛋白、 硫氧化还原蛋白及 ig的 fc段, 用间接 elisa法测定。（3）抗体蛋白纯度测定: 　抗体纯度测定采用 sds凝胶电泳分析。（4）ｉｇ类和亚类的鉴定: mab类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠 iga、 igg1、 igg2a、 igg2b、 igg3和 igm酶标抗体的间接 elisa试验检测。 　　1.2.4 mab在检测带his-tag的融合蛋白中的初步应用 （1）酶标抗体的制备及活性测定: 酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法: 将包被抗原用包被液稀释成100 ng/孔包被96孔酶标板, 4℃过夜, 洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体, 37℃温育 30 min, 洗涤; 加底物显色 20 min, 加终止液终止反应, 用酶标仪测吸光值。取a值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测: 采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带his-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。 　　2 结果 　　2.1 杂交瘤细胞株的建立及mab的特性鉴定 获得1株高亲和力、 高特异性杂交瘤细胞