HPLC原理和应用探析.pptVIP

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种新型微量分离分析技术。 高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。;一、HPLC与经典LC区别;2．HPLC：分离和分析 高压（1.47-2.94×1014 Pa）输送流动相，分析时间大大缩短 柱内径2~8mm，固定相粒径50μm（球形，匀浆装柱） 柱效高（H↓，n↑） 可以在线检测 ;二、HPLC与气相色谱（GC）的区别;GC;2．流动相差别;三、高效液相色谱仪流程图;高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统;9010 Solvent Delivery System;1、高压输液系统;高压泵;气动式放大泵;往复式柱塞泵;;2、 进样系统;目前HPLC的进样方式大致分为：注射式隔膜进样法、停流式进样法、阀门式进样法、自动式进样法。;B、停流式进样器;优点：进样器耐高压、加样时不影响泵连续工作、进样量准确、任意可调、重复性好、操作方便。缺点：在阀门接头和连接管的位置会产生少量死体积。;D、自动式进样器优点：耐高压、加样准确、重现性好、可连续进样、适于较大体积的样液。;一支层析柱的指标包括柱的形状、结构、层析介质和填充技术等，统称为层析柱技术（column technology）。;色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。;目前的层析柱主要分为填充柱和非填充柱两大类。 填充柱由不锈钢管或其它耐压材料制成的管材，并向内填充了具有高性能的层析介质组成的。;SEM IMAGE OF MONIDISPERSE Si PARTICLES;常用的高效液相层析商品柱，通常是已经填充好的。 对于特殊的填料或较大型的制备柱，需要自己填充。 填充方式：填料颗粒20 μm，多采用干法填充； 填料颗粒20 μm，采用湿法填充。;按照层析柱型号分;按照层析柱填料分;HPLC保护柱;4、检测系统;物理检测器：示差折光检测器 紫外检测器 荧光检测器 红外检测器 化学检测器：电导检测器;? ;二、辅助部分;2、脱气装置 常压下配制的溶液中会溶解少量气体分子，在高压下集结产生气泡，洗脱时产生脉冲，影响柱压稳定性。;3、梯度混合器：泵前混合（先混合再进高压泵，操作简单，易产生气泡）泵后混合（不易产生气泡，操作复杂）;4、自动收集器;第三节 高效液相色谱的分类;一、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography;二、液-液分配色谱liquid- liquid partition chromatography;三、离子交换色谱ion-exchange chromatography;四、排阻色谱size- exclusion chromatography;Figure 4.6. High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Gel filtration by HPLC clearly defines the individual proteins because of its greater resolving power: (1) thyroglobulin (669 kd), (2) catalase (232 kd), (3) bovine serum albumin (67 kd), (4) ovalbumin (43 kd), and (5) ribonuclease (13.4 kd). [After K. J. Wilson and T. D. Schlabach. ;五、亲和色谱 Affinity chromatography;六、反相高效液相色谱;第四节 高效液相色谱实验技术;一、样品的准备;二、流动相;2. 流动相类别;3. 流动相选择;常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) ;4. 选择流动相时应注意的几个问题;（5）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。;流动相在使用前应该过滤、脱气！除了在分析前利用真空或超声波脱气之外，