光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合结构域的相互作用的论文.docVIP

　　光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合结构域的相互作用的论文 光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的dna结合结构域的相互作用 【摘要】 利用荧光滴定法研究了9种金属离子与序列特异性的dna结合结构域(p53dbd)的结合反应，其结合能力依次为fe3+gt;zn2+gt;cu2+gt;ca2+gt;mg2+gt;ba2+gt;mn2+gt;ni2+gt;co2+。圆二色谱研究结果表明，ba2+, ca2+, co2+, mn2+及ni2+并未引起蛋白二级结构变化;　zn2+, mg2+及fe3+诱导蛋白结构细微调整;而cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失。ans结合研究结果表明, mg2+与zn2+相似，诱导p53dbd蛋白表面疏水性增强，而fe3+引起p53dbd蛋白表面疏水性降低。因此，mg2+和fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。 【关键词】 金属离子, 蛋白结构, 亲和性, 疏水性, 荧光光谱 　　1 引 言 　　自然界中大约1/4的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能[1,2]。??瘤抑制蛋白p53是zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程[3]。p53响应于多种dna损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因，从而可以导致细胞周期停留在g1/s期修复或者诱导凋亡[4]。所有这些已知的生物学功能都依赖于其dna结合特性[5]。.野生型p53通过一个序列特异性的dna结合结构域(p53dbd)来结合dna[6]。p53基因在50%肿瘤中发生突变[7]，而这些突变主要发生在p53dbd，突变的p53不能激活下游基因转录[8]。因此，p53dbd结合和转录激活活性是p53最关键的生物学功能。晶体结构研究结果表明，p53核心结构域结构为β三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和1个环片层螺旋模序。2个大环形成空腔结合zn2+，而环片层螺旋模序形成p53dna结合表面。p53dbd上的3个半胱氨酸(cys176, cys238和cys242)和1个组氨酸(his179)结合1个zn2+[9]。zn2+的结合被认为是p53核心结构域正确折叠所必需的，这种结合如果被破坏将会使p53dbd减弱甚至失去dna结合和转录下游基因的功能[10]。核磁共振研究表明：在没有zn2+的情况下，p53蛋白的dna结合表面发生了结构变化;荧光各向异性研究表明：zn2+的去除使p53dbd失去了位点特异性的dna结合活性，但保留着非特异性的dna结合活性[11]。另外，cu2+结合p53蛋白，却导致p53构象和dna结合活性的破坏[12]。然而，金属离子与p53dbd的结合平衡的研究尚未见报道。 　　细胞内存在多种金属离子，为了研究这些金属离子是否结合并影响p53dbd，本实验克隆并纯化了p53dbd蛋白，并在体外应用光谱法研究这些金属离子与p53dbd蛋白的结合反应，以及金属离子对蛋白结构及表面疏水性的影响。 2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　f4500荧光分光光度计(日本日立公司); jasco j715分光偏振计(日本分光株式会社)。8苯胺1萘磺酸(ans，sigma公司);二硫苏糖醇(dtt，merck公司);nacl(天津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(edta)、异丙基βd硫代半乳糖苷(iptg)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(sds)、四甲基乙二胺(temed)、trisbase及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;zncl2, mgcl2, cacl2, fecl3, mncl2, cocl2, cucl2, bacl2及nicl2均购于天津大学科威公司。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。 　　高渗缓冲液a(20 mmol/l trishcl，2.5 mmol/l edta，200 g/l 蔗糖，ph 8.0);低渗缓冲液b(20 mmol/l trishcl，2.5 mmol/l edta，ph 8.0);缓冲液c(20 mmol/l trishcl，50 mmol/l nacl，2 mmol/l cacl2，ph 8.0);缓冲液d(0.5 mol/l nacl，20 mmol/l trishcl，5 mmol/l 咪唑，ph 8.0);缓冲液e(0.5 mol/l nacl，20 mmol/l trishcl，80 mmol/l 咪唑，ph 8.0);缓冲液f(0.5 mol/l nacl，20 mmol/l trishcl， 300 mmol/l 咪唑，ph 8.0);缓冲液g(50 mmol/l trishcl，100 mmol/l nacl，1 mmol/l dtt，ph 7.5)。 　 2.2 p53dbd的基