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　　兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定的论文 【摘要】 目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白n2(high mobility group chromosomal protein n2, hmgn2)。方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱（rphplc）分离得到hmgn2，经过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳和gn2进行分子量测定和特异性鉴定。并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔hmgn2。对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌atcc25922有明显杀菌活性。结论：建立简单分离高纯度的hmgn2的方法。 【关键词】 兔胸腺；hmgn2；分离 高迁移率非组蛋白(high mobility group chromosomal protein, hmg)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族[9]，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前hmg蛋白分为三个亚家族，分别为hmga、hmgb和hmgn。hmgn2为hmgn亚家族的成员，其基因位于染色体1q35,相对分子质量为9.2kd，共由90个氨基酸组成。已有研究表明，hmgn2结合于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分[2,3]，参与dna的复制和转录[1]，与转录活性基因有关[5]，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动[6]。.cOm本实验室首次发现hmgn2具有明显的抗菌活性[4]。为了进一步研究hmgn2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺hmgn2。 1 材料和方法 1.1实验材料 主要材料:兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌atcc25922。主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，temed，蛋白质marker为merck产品；tris、tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（bsa）为simga产品；乙腈为fisher产品；抗hmgn2多克隆抗体为upstate产品；色谱纯水为millipore超纯水；考马斯亮兰r250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒bca protein assay kit为pierce公司产品；其余试剂为国产分析纯。主要仪器：高速离心机（beckman coulter avanti j30i,美国）、反相高效液相色谱仪hp1100(惠普公司)、电泳装置为（biorad po,流速为1 ml/min。收集每个单峰的洗脱液，真空冷冻干燥后溶于无菌水中进行鉴定。 1.2.3 聚丙烯酰胺凝??电泳（tricinesdspage）及尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（aupage）初步鉴定hmgn2 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初步确定上述各单峰的相对分子量，以及其纯度，所用浓缩胶浓度为4%t、3%c,分离胶浓度为16.5%t、3%c。胶厚0.75nm。电泳条件: 80v恒压,3.54小时。电泳完毕后进行考马斯亮蓝染色1小时,脱色过夜后进行观察。 1.2.4 gn2tricinesdspage电泳完毕后，利用半干转移法将胶上条带转移到pvdf膜上，10%bsa封闭1小时膜后，加入hmgn2抗体4 ℃孵育过夜，次日漂洗后用辣根过氧化酶标记的抗兔igghrp室温孵育1小时后，洗涤三次，pvdf膜蛋白面向上，dab显色液显色后观察试验结果。 1.2.5 hmgn2对大肠埃希菌的杀菌功能鉴定参照lehrer等[14]的方法对hmgn2的抗菌功能进行检测:用pbs作为阴性对照，hnp为阳性对照，hmgn2的稀释浓度依次为4、2、1、0.5 μg·μl1。37 ℃孵育过夜，观察杀菌环直径大小判断杀菌功能强弱。实验做三复孔，重复三次。 2 实验结果 2.1hmgn2分离纯化及鉴定 新鲜兔胸腺组织酸溶性粗提物经rphplc分离后各组分出峰时间如图1所示，主要色谱峰集中在2040分钟。第20分钟的分离物为兔胸腺hmgn2。图2显示经rphplc所得的第二十分钟分离物行tricinesdspage电泳后考马斯亮蓝染色分析结果，可见其分子量介于14和18之间。图3所示为gn2经dab显色液显色后结果。 2. 2hmgn2杀菌功能鉴定 结果见表1,hmgn2样品浓度为4 μg·μl1，点样量为5 μl，每组实验重复三次，表内显示hmgn2对大肠埃希菌有抑菌活性，抑菌直径（d）d≥8mm为＋＋＋。表1 hmgn2对大肠埃希菌的抑菌作用 　　3 讨论 hmgn2作为hmg三大家族的一员，是进化保守的，因其分子量小，聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移快速而得名。因其含量丰富，学者们对它的研究也是极其广泛的。早在80年代就有不