第十讲动物细胞培养生物制药II.ppt

第10讲 动物细胞培养生物制药II;本节主要内容;本节关键问题;一 适合大规模培养的细胞株;;3.适合工业化生产的细胞株;（1）原代细胞;（2）传代细胞;（3）转化细胞;转化方法;;;;（4）融合细胞;二 动物细胞大规模培养;（一）定义;（二）转管/瓶培养系统;（三）动物细胞生物反应器培养;;问题讨论：;动物细胞培养的生物反应器;1、搅拌罐式生物反应器;;笼式通气搅拌生物反应器;机械搅拌结合鼓气的生物反应器;2、气升式生物反应器;;3、中空纤维生物反应器;柱式中空纤维生物反应器;板框式 中心灌流式;;(四)动物细胞大规模培养的方法;1、悬浮培养;2、贴壁培养;3、贴壁－悬浮培养;2.微载体培养技术;1967年，维茨尔（Van Wezel）开发了微载体系统。 微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。同时，微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能，既能满足动物细胞的贴壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。;理想的微载体需具备的条件;⑤粒径在60～250μm（溶胀后）之间为好，并要尽可能地均一，差异不大于20μm。这样有利于细胞均匀地分布在各微载体表面； ⑥具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况； ⑦基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载体互相磨擦而损伤细胞； ⑧可耐121℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌； ⑨经简单的适当处理后，可反复多次地使用； ⑩原料充分，制作简便，价廉。 ;制备微载体的材料;微载体分类;;（1）微载体培养;1.游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。 2.吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。 3.繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出现接触性抑制。 4.退化期：细胞长满载体表面，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞脱落死亡。;微载体培养;影响贴壁的因素;培养基组分：添加血清有助于细胞贴壁。提供促接触和伸展因子。 搅拌：不能仅依靠大的搅拌速率保证接触概率。在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 其它因素：培养基偏酸或偏碱、微载体不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。;;细胞收获与微载体再生的具体方法举例;;球传球接种技术;;优点;微载体培养步骤;4)培养观察与细胞计数。在显微镜下直接观察微载体上细胞的生长情况,将微载体上的细胞消化后计数并计算其浓度。 5)消化。传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体,通常采用酶消化法。 6)分离细胞。对于回收率要求不高的细胞种类分组沉降简单易行,而若要求高回收率,则可用过滤方法,采用100μm孔径的尼龙网、不锈钢网、多孔玻璃滤器等将细胞与微载体分离开。 7)传代培养。微载体上分离后的细胞可进一步做微载体传代培养。如果进行放大、培养,可在细胞脱离微载体后加入一些新的微载体以增加培养体积,提高培养液的利用率,但此法比全部用新微载体的细胞得率低。 ;（2）包埋和微囊培养;;（四）动物细胞培养的影响因素;1.细胞凋亡;细胞凋亡会减少细胞浓度，降低目标物质产量;;补充的营养成分;灌注培养;导入细胞凋亡抑制基因;;三 动物细胞??低温保存;;;;补充文献：;下节内容 动物细胞培养生物制药的应用 预习文献资料