细胞生物学实验_细胞融合.pptVIP

细胞融合实验;概念 促融合剂与融合技术 应用与意义 ;一 定义： Cell fusion;;;在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。 种内杂交细胞（intraspecific hybrid cell）:同种细胞融合而成的细胞 种间杂交细胞（interspecific hybrid cell）: 不同种的细胞融合而成的细胞 ;非对称细胞融合（asymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。 ;细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法： 1.物理方法，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活； 2.化学方法，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。;动物克隆;上海第二医科大学 陈莹博士;二细胞融合的原理;;显微镜下的细胞融合过程;细胞融合的过程;; 细胞融合过程中两个细胞膜的变化;细胞融合分为两种： 1.自发细胞融合 2.人工诱导细胞融合;（1）自发细胞融合;;1.病毒诱导法;病毒促使细胞融合 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透 -------- 细胞核互相融合 ，进入正常的细胞分裂途径，杂种子细胞。;2化学法（聚乙二醇）;;聚乙二醇; 基本原理;聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合;;3.物理法一电融合诱导法;细胞电融合;+;双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。;;;原生质体电融合过程;注意事项;优点：;融合指数（fusion index）: 反映细胞融合的效率 有两种计算方法： 1.FI=（对照组细胞数-试验组细胞数）/试验组细胞数 2.FI=多核细胞中的细胞核数/所有细胞中的细胞核数;不同细胞融合的条件及其主要应用;;;动物细胞融合影响因素;;比较常用的杂种细胞筛选方法;1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。 亲本A：HGPRT- /TK+ 亲本B：HGPRT+ / TK- 杂交细胞：HGPRT+ / TK+ 在HAT培养基中杂交细胞存活，A、B死亡 ;2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一 种或几种营养成分时，不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细 胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。;3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：低温敏感突变型，可在低温下生长，在高温下死亡。 亲本二：高温敏感突变型，可在高温下生长，在低温下死亡。 杂种细胞能在高温和低温下生长。;细胞融合的应用;细胞融合应用;The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies;单克隆抗体的概念;亲本细胞的准备;单克隆抗体的大量制备过程;;;;(二)骨髓瘤细胞的获得与培养;骨髓瘤细胞的准备; 细胞融合;二 细胞融合;小白鼠脾臟細胞 B 與 癌細胞 N 以 PEG 進行融合，操作在 10 min 內完成 (如下圖)，隨即把細胞平均分配在 96 槽細胞培養盤 中 ;;;;三 杂交瘤细胞的筛选;HAT培养基筛选杂交瘤细胞;HAT选择系统;杂交瘤技术中，常选用 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。 HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。 ;淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT- 或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。;四 可分泌特异性单克隆抗体 的杂交瘤细胞的筛选;五 杂交瘤细胞的克隆化培养;杂交瘤细胞的克隆化培养;;;;1.有限稀释法;;2 .软琼脂培养法;;;;4.荧光激活分离法;;;;;大量生产单克隆抗体：;2）腹水的制备：;;;单克隆抗体的应用