基于电化学聚合固定抗体的电化学发光免疫分析法检测人免疫球蛋白的论文.docVIP

　　基于电化学聚合固定抗体的电化学发光免疫分析法检测人免疫球蛋白的论文 【摘要】 　　基于电化学聚合在金电极表面固定兔抗人免疫球蛋白g抗体与人免疫球蛋白g及标记有ru(bpy)2+3 的羊抗人免疫球蛋白g抗体之间发生特异性免疫反应，形成三明治结构，成功建立了用于测定人血清中免疫球蛋白g的电化学发光(ecl)免疫技术。利用此方法测定人免疫球蛋白g含量，浓度在50 μg/l～2 mg/l范围内与电化学发光强度呈良好的线性关系，线性回归方程为y(a. u.)=48.41+0.09x(μg/l) (n=7)；检出限为20 μg/l (3σ)。测得正常人血清中免疫球蛋白g平均含量为11.2 g/l ，结果令人满意。 【关键词】 人免疫球蛋白g 电化学发光 免疫检测 电化学聚合 　　1 引言 　　免疫检测法具有快速、灵敏、选择性好等特点，被广泛应用于临床诊断、法医学、药物学和环境科学等研究领域[1～６]。特别是近年来，随着对免疫传感器的深入研究，发展了多种检测技术，包括电化学、光学、压电检测、放射免疫分析法和电化学发光检测法等[７～1２]。其中，放射免疫分析法涉及环境污染问题，酶免疫分析法受到酶保存和检测灵敏度的限制；荧光免疫法有光的散射和杂光的干扰等问题，限制了其在免疫方面的应用。电化学发光是一种由于电化学反应引起化学发光的现象，具有操作简便、背景信号低、易于控制、特异性高等特点。.ru(bpy)2+3化合物在电化学发光中是一种应用最为广泛的发光物质，由于它具有灵敏度高，稳定性好，发光效率高等特点，所以被广泛用于实际生物样品的分析检测[1３,1４]。 　　免疫球蛋白(igg)是人体血清中含量最高的抗感染抗体，约占血清免疫蛋白的70%～80%，其含量的高低往往作为慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的参考值，所以对其含量检测意义重大。现有igg检测方法有压电免疫传感器技术[1５]、酶免疫法[1６]和荧光免疫法[1７]等。 　　对于生物传感器，生物分子固定的数量和活性是非常重要的，直接影响传感器的性能。传统的固定方法，如硅片上的硅烷化固定技术、金电极表面的巯基自组装法以及戊二醛等化学试剂组装法等，操作复杂，组装时间长，难以保持生物分子的活性。采用吡咯和生物分子共聚的方法，不但操作简便、耗时少、易于控制，还能适用于微电极及微量试剂的选择性固定。这种方法常用于酶传感器、安培传感器及电位传感器，应用于电化学发光免疫传感器却少有报道。本研究采用聚合吡咯和抗体的方法将抗体固定到金电极表面通过三明治免疫结合法实现对人igg的电化学发光免疫检测，结果令人满意。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　mpie型电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）；chi630电化学工作站(美国chi公司)；三电极工作体系：金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，参比电极为ag/agcl电极(3.0 mol/l kcl)。 　　ru(bpy)2+3nhs ester用于标记抗体（美国sigma公司）；羊抗人igg，人igg，兔抗人igg，牛血清蛋白(bsa)(北京鼎国生物技术有限责任公司)；健康人血清由华东师范大学校医院提供；吡咯(国药集团化学试剂有限公司)；透析袋(上海源聚生物科技有限公司)；发光检测液：1.0×10－3 mol/l 三丙胺(tpra)＋5.0×10－3 mol/l liclo4 ＋2.0×10－2 mol/l 磷酸盐缓冲溶液(ph 8.7)；其它试剂均为分析纯，所有溶液均用aquapro系统制得的蒸馏水配制。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 ru(bpy)2+3 标记羊抗人抗体的制备 参照文献[18]方法，称取1 mg ru(bpy)2+3nhs ester溶于100 μl二甲亚砜中，再将此混合溶液加入到1 ml羊抗人igg中，在37 ℃的条件下避光搅拌12 h后，将溶液转移至透析袋中，用磷酸盐缓冲溶液(ph 7.2)透析除去未标记的ru(bpy)2+3，直到透析液没有ecl信号。透析袋内即为标记有ru(bpy)２＋3的羊抗人igg。 　　２．２．２ 电化学聚合吡咯固定抗体 将金电极在金相砂纸上抛光后置于无水乙醇和蒸馏水中分别超声清洗 5 min，于－1.0～+1.0 v电位下在0.1 mol/l h2so4溶液中循环扫描20 min，取出后用蒸馏水冲洗干净，将新鲜处理好的电极浸入含有0.1 mol/l 吡咯、0.1 g/l兔抗人igg、0.1 mol/l kcl 的0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph 7.2)中，在800 mv的电压下聚合200 s，取出用蒸馏水冲洗干净。 　　２．２．３ 免疫组装和电化学发光检测 将1%bsa滴加到修饰有抗体的电极表面作用20 min后，再滴加10 μl人igg溶