质粒提取-酶切鉴定.pptVIP

实验一 质粒提取及酶切鉴定; 基因工程（genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。;目的基因 工具酶 载体;质粒 存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型环状DNA分子(covalent closed circular DNA)。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物 经改造后具有多克隆位点。; 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状;限制性核酸内切酶： ------基因工程的手术刀 是分子生物学研究中的一种工具酶，能识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： ? EcoRⅠ：G↓AATTC ? HindⅢ：A↓AGCTT; 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统（restriction-modification system），限制外源DNA， 保护自身DNA。;分类;（1）识别及切割位点相同 （2）识别序列通常为4～8bp的回文结构； （3）切割可产生两类切口，三种末端。 ;Ⅱ型酶识别序列特点— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;;质粒提取原理;溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。;Relaxed circle;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;与DNA分子量标准物（Marker）比较能大概判断未知DNA的分子量 质粒DNA为环状，在酶切彻底的情况下，DNA片段数与酶切位点数目相同;Marker;操作步骤(Methods);（2）取1.5 mL离心管一支，加入1.4 mL菌液，13 000 r/min离心1 min去掉上清液。加入150 μL 的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置10 min。 （3）加入200 μL新配制的溶液Ⅱ。加盖，颠倒5次使之混匀。冰???放置5 min。 （4）加150 μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5次混匀，冰上放置15 min。13 000 r/min离心5 min，取400 μL上清液移入另一离心管中。;（5）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，13 000 r/min离心2 min，300 μL上清液转移至新的离心管中。 （6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （7）加入1 mL 70 %乙醇，震荡并离心， 13 000 r/min离心2 min，倒去上清液，晾干，加入20 μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。;2.质粒DNA的酶切鉴定