甲基绿派洛宁法显示细胞内DNARNA的分布实验报告山东大学.docVIP

山东大学实验报告 2013年 10月14日 科目 细胞生物学实验 题目 甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、RNA的分布 第  PAGE 4 页 共  NUMPAGES 4 页 细胞生物学实验报告· 甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、RNA的分布 【实验目的】 学会制作血涂片； 熟悉甲基绿——派洛宁法显示核酸的原理与操作步骤； 观察DNA、RNA在细胞中的分布。 【实验原理】 1、电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。 甲基绿、派洛宁为两种碱性染料，在水中电离后，都产生带阳电荷的离子，常与带负电荷的磷酸根形成盐键。 甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强，易与双链DNA分子（胞核等电点pH3.8～4.2）进行极性吸着而结合，使DNA显示绿色；派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，与单链RNA（胞质等电点pH4.6～5.2）吸附结合，使RNA显示红色。 2、聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。因此，甲基绿选染DNA，而派洛宁选染RNA。 【甲基绿——派洛宁法实验步骤】 1．取蟾蜍（蟾蜍破髓，仰位剪去下颌、舌头）制备血涂片，干燥后滴加70%的乙醇溶液固定10分钟，晾干。 2．滴染色液于血膜上，染15分钟。（或在染色缸中） 3．蒸馏水冲洗，去染液。 4．向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色、同时倾斜载片弃液体，晾干。 5. 观察。 甲基绿—派洛宁染液配制 试剂：0.2mol/l醋酸缓冲液（PH4.8） A液：冰醋酸1.2ml+蒸馏水至100ml B液：醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72克溶于100ml蒸馏水中 使用时，A液与B液按2：3比例混合。 甲基绿—派洛宁染液 A液:2克甲基绿加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。 B液:1克派洛宁Y加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。 临用时，A液于B液5：2混合。 甲基绿派洛宁法试剂配制（改良Cook，1974） （一）2%甲基绿水溶液： 甲基绿（methyl green）1g 蒸馏水加至50ml 用三氯甲烷抽提，方法详后。 （二）5%派洛宁水溶液： 派洛宁G（pyronine G）1g 蒸馏水加至20ml （三）0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 0.2M醋酸液41ml 0.2M醋酸钠液59ml （三）甲基绿派洛宁染液： 2%甲基绿水溶液（经抽提） 5ml 5%派洛宁水溶液 1ml 蒸馏水 12ml 0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 18ml 甲基绿派洛宁染液的pH值必须严格控制 PH4.8时，甲基绿与派洛宁分别对DNA和RNA有亲和性，可获较好结果 PH9时，甲基绿着色，派洛宁不着色。 PH极低时，甲基绿不着色 DNA和RNA染色液（MGP染色液）原理方法：Vnna-Pappenheim氏甲基绿派洛宁法。 适用范围：适宜组织石蜡切片染色。 产品组成：A试剂（酶染剂）3瓶 B试剂（PMG染料）3瓶 染色方法：1、组织切片脱蜡至水。2、A试剂（酶染剂）染色5分钟；3、B试剂（PMG染料）染色10～30分钟；4、水洗，此时切片应呈淡绿色，若偏红，可用冷丙酮快速分色；5、热风吹干切片，二甲苯透明，中性树胶封固。结果参考：DNA呈浅～深绿色，RNA呈粉红色。有效期：十二个月。贮存：常温保存。 【实验用品】 材料 蟾蜍 试剂 蒸馏水、70%乙醇溶液、95%乙醇溶液。 3．器材 解剖针、载玻片、盖玻片、显微镜、镊子。 【操作步骤】 取蟾蜍（蟾蜍破髓，仰位剪去下颌、舌头）制备血涂片，干燥后滴加70%的乙醇溶液固定10分钟，晾干； 滴两种染色液分别于???张血膜上，染15分钟。（或在染色缸中）； 蒸馏水冲洗，去染液； 向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色，同时倾斜载片弃液体，晾干； 观察。 【实验结果】 甲基绿——派罗宁染色液1 甲基绿——派洛宁染色液2 【实验结果分析与注意事项】 分色的时间和次数掌控特别重要，时间过长或次数过多会导致镜下观察细胞基本没有颜色。 制作血涂片的时候，推片的技术和力度等需要掌控好。