放射免疫检测技术教程.ppt

放射免疫检测技术;基本内容;一、放射免疫检测技术的基本原理;1、7个基本概念 ⑴放射性核素：是指原子核能自发地产生成分或能级的变化，在变化时伴有射线的发射（放射性），然后变成另一种元素的核素。 ;1、7个基本概念 ⑵放射性活度：一定量的放射性核素在单位时间内的核衰变数，即每秒核衰变次数。 单位：贝可勒尔(Becquerel，Bq) 1Ci=3.7×1010Bq ;1、7个基本概念 ⑶放射性比活度：是指固体样品的放射性活度，即单位质量样品中所含放射性活度，以Bq/g或Bq/mmol表示 。 ⑷放射性浓度：是指液体样品的放射性活度，即单位体积溶液中所含放射性活度，以Bq/ml表示。;1、7个基本概念 ⑸比活度：是单位质量标记物的放射强度，单位为Bq/?g。 标记抗原的比放射性越高，所需标记抗原量越少，实验系统的敏感度越高。 但过高的比放射???可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。 ;1、7个基本概念 ⑹放射化学纯度：是指结合于抗原上的放射强度占总放射强度的百分率。 影响因素: ①被标记物不纯，杂质也被放射性核素标记； ②标记后的分离纯化不完全； ③标记化合物贮存过程中的碘脱落。;1、7个基本概念 ⑺免疫活性：指标记抗原结合于抗体的放射强度占总放射强度的百分率。 以检查标记后免疫活性损失情况。;2、常用的放射性核素： 放射性核素依据衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。 β型：3H（最常用）、14C和32P。 γ型：125I（最常用）、131I、51Cr和60Co。;125I和3H标记物特点比较 ;3、放射性核素选择原则 高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗体没损害、容易标记。 4、放射性标记的抗原或抗体的要求 纯度高、灵敏、有足够或完整的免疫活性、高亲和常数、特异性强、交叉反应率低。 ;5、制备放射性核素标记物 ⑴直接标记法 将125I直接结合在蛋白质侧链的酪氨酸残基苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。 操作简便，结合效率高，但只能标记含酪氨酸的化合物，有时可能会损害蛋白质的活性。 ⑵间接标记法 先将放射性碘连接到一个小分子载体上，再将这个小分子载体与蛋白质结合。 ; 6、放射性标记物的纯化 可用葡聚糖凝胶过滤法或薄层层析法、纸层析法、电泳法、高效液相层析法等。 理想的放射性标记物： 高放射化学纯度 适当的比放射性 高的免疫活性。 ;7、理想的分离技术 ①简便易行，适于大批量样品分析; ②分离效果完全、快速，非特异结合低; ③试剂来源容易、价格低廉、稳定性好、可长期保存; ④不受外界因素和样品中其他组分的干扰，对标准品和待测抗原分离效果相同; ⑤适合自动化分析的要求。 ;8、免疫复合物分离常用方法 ⑴.吸附法 用吸附剂 (如活性炭)吸附小分子的游离。 ⑵.化学沉淀法 RIA反应条件接近抗体的等电点，加入聚乙二醇(PEG)等蛋白质沉淀剂可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀，从而分离B与F。 ⑶.双抗体法 利用抗抗体和※Ag-Ab复合物中的抗体结合，形成更大免疫复合物，离心沉淀即可分离B与F。 ⑷.PR试剂 将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法，可弥补各自的不足，分离效果好，适用范围广。 ⑸.固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体（如磁颗粒、聚苯烯管子或珠等）上，利用固相抗体或抗原分离B和F，具有简便、快速、适合于自动化分析等特点，已逐步取代传统的液相分离方法。;9、核射线探测仪器的探测原理 核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。 转换模式：放射能→光能→电能→脉冲。;二、放射免疫分析（RIA）;二、放射免疫分析（RIA）;2、分类 根据加样顺序不同，RIA可分为2个类型： ①平衡法 将Ag和※Ag同时与Ab反应，达到平衡后分离※Ag-Ab和※Ag，方法稳定，但敏感度稍差； ②顺序饱和法 先将待测Ag与Ab充分反应，达平衡后再加入※Ag，敏感度提高，稳定性不如平衡法。