改进的18Ｏ同位素标记法标记蛋白质多肽的论文.docVIP

　　改进的18Ｏ同位素标记法标记蛋白质多肽的论文 【摘要】 针对18ｏ同位素标记反应两个重要影响因素——肽段分散度和胰酶灭活方法，进行了标记条件的改进和灭活方法的优化。在h218ｏ中加入rapigesttm sf助溶剂并微波辅助加热，使α-酪蛋白胰酶酶切肽段的标记效率得到明显改进（18ｏ/16ｏ 峰面积比值gt;99%）。标记后，对胰酶进行还原烷基化化学修饰彻底灭活，使标记后的肽段稳定性显著提高，放置6 d不发生回交反应。对标准蛋白质甲状腺球蛋白酶切肽段混合物标记后的质谱实验结果表明：优化的标记方法能快速稳定地标记蛋白质酶切多肽。 【关键词】 18ｏ同位素标记；多肽；蛋白质组 peptide labeling proved 18ｏ incorporation methodzhao yan，lu zhuang，jia ics，beijing proteome research center，beijing 102206(beijing institute of radiation medicine，beijing 100850)abstract in order to optimize the18ｏ labeling method，t sf in h218ｏ and microical modification ide(iaa) resulted in trypsin deactivated pletely.no significant back-exchange from 18ｏ to16ｏ ent result ixture from shoproved method could be effectively used to label protein and peptide. 　　keye 　　1 引言 　　定量蛋白质组学通过批量观察正常与疾病细胞或组织在蛋白质表达谱上的差异，从整体水平上规模化筛选和发掘与疾病相关的蛋白，为致病机理研究和临床应用提供重要参考信息。18ｏ同位素标记技术是定量蛋白质组的一种常用技术 [1~5]。蛋白质酶切后的肽段，在胰蛋白酶的催化下，c-末端的两个16ｏ原子被替换成18ｏ原子，从而使质谱检测产生4 da的质量差异。通过比较标记肽段和未标记肽段的峰面积强度，得到一对蛋白样本的相对定量关系。尽管该标记反应具有条件温和，标记前后肽段的理化性质不发生改变，能和肽段的其它分离分析方法兼容等优点，但却由于反应条件极难控制，反应后标记产物不稳定而影响其在实验室的广泛应用。 　　本研究基于18ｏ同位素的标记原理，讨论了肽段分散度和胰酶灭活两个重要因素对标记的影响，并据此对方法进行了优化。相比文献[6]采用的水浴孵育标记和沸水加热灭活技术，本方法标记时间短，标记效率强，抑制回交反应。实验结果显示，即便对于复杂的多肽混合物体系，采用本方法也能获得高效的标记结果（18ｏ/16ｏ峰面积比值gt;99%）。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　4800基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（maldi-tof-tof ms，美国applied biosystems公司）。 　　α-氰基4-羟基肉桂酸(chca)、甲状腺球蛋白、α-酪蛋白（美国sigma公司)；测序级胰蛋白酶(美国 promega公司)；97% h218ｏ(上海化工研究所)；三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（tcep，sigma公司）；碘乙酰胺(iaa，美国ne sf（美国mol/l nh4hco3溶解后，加入rapigesttm sf（终浓度 0.1%）和tcep（终浓度 5 mmol/l），在56 ℃还原1 h，再加入iaa （终浓度25 mmol/l）， 放置暗处还原1 h。加入胰酶-底物（1∶50，in。加入tcep（终浓度100 mmol/l）灭活，37 ℃水浴孵育1 h后，微波反应10 min。再加入iaa（终浓度100 mmol/l），于暗处放置1 h。 　　2.4 质谱分析 　　基质采用chca。仪器控制软件为4800 explorerｔｍ softs-1 kv反射模式，加速电压20 kv，扫描范围m/z 700~3500，激光能量4500，每张谱图累加1500次。马心肌红蛋白胰酶酶切肽段作为标准物对仪器进行外标校正，校准至误差≤0.1 da，相对标准偏差≤10×１０－６。 　　3 结果与讨论 　　3.1 增强蛋白质酶切肽段的标记效率 　　蛋白质酶切肽段18ｏ标记方法的原理是基于胰蛋白酶催化产生的两次酶-肽段复合物水解反应。该反应是快速的动态可逆反应。因此，经常发生标记效率不完全和标记肽段发生回交的情况， 有效地控制标记和回交抑制这两个环节是实验成功的关键[7，８]。 　　本实验通过改善肽段在反应体系中的分散程度和辅助加热，增加