犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的论文.docVIP

　　犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的论文 【摘要】 目的 表达犬细小病毒vp2 蛋白（cpv vp2），用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和vp2 蛋白功能研究。方法 采用pcr方法对cpv vp2基因进行扩增，将cpv vp2基因克隆到毕赤酵母 (pichia pastoris) 分泌表达载体ppiczαa中，构建真核重组表达载体ppiczαavp2，将该重组质粒线性化后，转化毕赤酵母菌gs115中，在甲醇诱导下表达cpv vp2，sdspage和ing2， cao zhen2，edicine of chinese agriculture university，beijing 100094； 2. national veterinary diagnostic center of ministry of agriculture，beijing 100094，china) 【abstract】 objective to establish a yeast pichia pastoris expression system expressing canine parvovirus vp2 protein (cpv vp2) to serve the diagnosis of cpv，development of cpv vaccine and research of vp2 protein function. methods cpv vp2 gene plified by pcr，cloned into secretory pichia pastoris expression vector ppiczαa，and ed ppiczαavp2. after being linearized e digestion，the vector ed into pichia pastoris gs115 by electroporation method. the cpv vp2 protein expressed ethanol induction. the expressed protein in yeast plified，sdspage and against cpv. conclusion cpv vp2 has been successfully expressed in yeast pichia pastoris. the expressed cpv vp2 protein shares reaction against cpv. 【key 109感受态细胞购自promega公司，c表达载体ppiczαa、毕赤酵母gs115菌株及抗生素zeocintm购自invitrogen公司。 1.1.2 主要试剂、试剂盒及培养基：限制性内切酶ecorⅰ、xbaⅰ、sacⅰ、dna maker购自大连宝生物技术有限公司；taq dna polymerase、dntp、t4dna连接酶购自promega公司。小量胶回收试剂盒、酵母基因组dna提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司，质粒纯化试剂盒购自博大泰克公司，低盐lb、ypd、mdh、mmh、bmgy、bmmy等培养基均按照invitrogen公司毕赤酵母表达说明书配制［2］。辣根过氧化酶标记羊抗犬酶标二抗购自中杉公司。 1.1.2 引物: 根据已发表的cpv的vp2基因dna序列，利用primer 5.0软件设计一对引物，上游引物中含有ecori限制性酶切位点，下游引物中含有xbai限制性酶切位点，重组表达质粒的pcr鉴定所用引物根据表达载体ppiczαa上的5′aox1和3′aox1引物位点合成，引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如下： 上游引物vp2f：5′gcgaattcatgagtgatggagcagtt3′;下游引物vp2r： 5′actctagatataattttctaggtgc3′; pcr鉴定引物：5′aox1：5′gactggttccaattgacaagc3′; 3′aox1：5′gcaaatggcattctgacatcc3′; 使用液浓度为10 pmol/μl。 1.2 方法 1.2.1 cpv dna 的提取： 采用酚氯仿异戊醇方法提取病毒dna，沉淀用50 μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。 1.2.2 pcr扩增vp2基因： 以上步提取的dna为模板，利用特异性引物vp2f/vp2r扩增vp2基因。pcr反应体系20 μl：ddh2o 8 μl，10×pcr buffer 2 μl，2.5 mmol/l dntp 2 μl，15 mmol/l