DotBlot检测的流程.docVIP

第九章 免疫学活性测定 Dot blot 原理： 原理：抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测，工作量很大。因此快速简洁的定量分析是检测细胞表达水平监测的重要手段。主要监测方法包括Dot blot 和ELISA。 Dot blot Dot blot是最快速简捷的方法之一，简述如下：在超净台内，使用无菌多孔加样器将96孔板内的细胞克隆培养液以5μL上样量，成排点于硝酸纤维素膜上并风干，记录好样品顺序（可在膜的正面边缘处标记正面及名称，也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记，识别膜的正反面及方向）。取上面风干好的硝酸纤维素膜，用配制好的封闭液（脱脂奶粉或白蛋白溶液）室温震荡孵育至少一小时。此步骤的目的是封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点，以避免下一步加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的硝酸纤维素膜浸泡在第一抗体中，室温震荡孵育1小时，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，将膜浸泡到TTBS溶液中，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。将洗涤后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中，室温震荡孵育1小时，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，将膜浸泡到TBST溶液中，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。最后，将膜浸于荧光显色剂（新鲜刚刚混合的等量A和B液）。1-2分钟后将浸泡过的膜，抖去多余显色剂，夹入保鲜膜（保鲜膜应薄而透明，以免阻挡曝光效果）中，同时观察显色情况，确定大致曝光时间（一般情况下，如果样品亮度肉眼可见且较强，那么初次曝光时间应较短，一般选3-5秒；如果样品亮度肉眼不可见，则初次曝光时间应略长一些，一般选择1分钟），曝光完毕，经显影，定影后，用清水冲洗X光胶片，根据胶片上结果情况，再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、定影反应。溶液配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。Dot blot需要TTBS溶解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。同时样品倍比稀释也是半定量所必需。 附1：Dot-Blot操作流程图 以下均用微振摇床混和 一、试剂 1、抗待检样品抗体： 第一抗体为纯化鼠抗人IgG Fc单抗； 第二抗体为HRP-兔抗小鼠IgG二抗。 2、封闭液（5%脱脂奶粉） 3、底物荧光显色剂A、B 4、TTBS(10×) 缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.5g，NaCl 45g，吐温-80 5.5ml，加适量超纯水溶解，用浓盐酸(～32ml)调PH7.5，补加超纯水至500ml。置于棕色瓶中，4℃保存，有效期6个月。用前10倍稀释为1×TTBS缓冲液。 二、操作 1、取硝酸纤维素膜1张，将标准品倍比稀释、样品、阴性对照、阳性对照点在膜上，风干。 2、将膜置于封闭液（5%脱脂奶粉溶于超纯水中）室温封闭1小时（也可4℃过夜封闭）。 3、弃去封闭液后，加入含有待检样品第一抗体的TTBS缓冲液30mL（抗体稀释度为1：1000），且其中含有1%的脱脂奶粉，室温震荡孵育1小时。 4、将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。然后再用TTBS缓冲液震荡洗涤3次,每次5分钟。 5、弃去液体后，加入含有第二抗体的TTBS缓冲液30mL（抗体稀释度为1：2000），室温震荡孵育1小时。 6、将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。然后再用TTBS缓冲液震荡洗涤3次,每次5分钟。 7、取出硝酸纤维素膜，略除去膜上多余溶液后，加入适量的荧光显色剂A、B（一般1/2张96孔板大小的膜加4mLA、B混合液，且A液：B液=1：1）。 8、用保鲜膜将硝酸纤维素膜覆盖，尽量平整，避免产生气泡，并放在曝光夹上，根据样品及标准品的亮度，初步确定曝光时间（一般情况下，如果样品亮度肉眼可见且较强，那么初次曝光时间应较短，一般选3-5秒；如果样品亮度肉眼不可见，则初次曝光时间应略长一些，一般选择1分钟），然后取适当大小的胶片覆盖在薄膜上，关夹曝光。 8、曝光后，取出胶片浸于显影液中，在红光下观察，直到胶片上的样品点不再变化为止（~1.5分钟），取出胶片在水中涮洗一下（此步骤避免显影液与定影液混合，降低定影液使用效率），再放入定影液中，当胶片本底呈现蓝色透明后，即可取出胶片进行流水冲洗，洗净后晾干即可。 此实验中的注意事项： （1）在整个操作过程中，手不能直接接触硝酸纤维素膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解； （2）脱脂奶粉封避一定要充分，否则容易造成膜与蛋白的非特异性结合，导致结果片中出现杂点或假阳性，干扰试验结果。 （3）一抗浓度与二抗浓度不宜过高，否则容易造成高背景或者杂点。适宜浓度的选择，可以通过不同浓度组合的预试验进行确定。 （4）暗室一定要确