WesternBlot中的3大问题.docVIP

Western Blot中的三大问题 想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。 Question:我的结果是膜上一片空白，为什么呢? A:导致这种结果的因素很多。 胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。 转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说，蛋白越大，转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。 在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。 试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20℃。 抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。 酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的Western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，只能使用蒸馏的去离子水。 使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使背景升高。 检测系统缺乏足够的灵敏度：确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内： 辣根过氧化物酶 500pg/band 碱性磷酸酶 100pg/band 增强的碱性磷酸酶 5pg/band 胶体金 100pg/band 增强的胶体金 10pg/band Immun-Star化学发光 10pg/band Q：我的Western blot总是背景过高，如何解决? 应该是多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。 封闭不完全：一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能再4℃孵育，因为会凝结。如果想在低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景! 显色过度：显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰课件，而背景几乎没有货很少时，将膜及时取出。 转移缓冲液或设备污染：使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外 ，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。 抗体稀释度不正确：一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。抗体稀释度不够，会产生非特异性的结合，带来高背景。 二抗不纯：没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。 Q：在转膜的过程中，缓冲液总是很热，我该怎么办? A: 如果缓冲液过热，它就会分解，产生更多的热量。这可是一个大问题。为了避免分解，一定要确保你的冷却设备没问题，使用的是推荐的缓冲液，而且不在过高的功率下转印。 足够的冷却的条件：在大部分情况下，都应当使用循环冷却水来进行冷却。在冷库中转印，或将转印槽放置在冰浴中都是不行的。因为大部分转印槽都是塑料做的，不能有效地散热。另外，由于胶附近的缓冲液通常是静止的，在转印过程中应搅动来维持循环。 缓冲液：转印缓冲液的离子浓度必须是已知的，来防止过热。如果离子浓度过高，电压就应该降低(恒流转印)，如果是恒压