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微生物检验手册 中国食品安全中心 菌落总数 1、实验材料 电子天平, 药匙, 锥形瓶 (500 ?), 高压灭菌锅, 生化培养箱(35 ℃), 灭菌均质袋, 固定夹, 均质机,移液枪,吸管(10 ?,25 ?,1?), 一次性平板 (直径9~10 cm,高度1.5 cm), 菌落计数器, 酒精,灭菌试管(18 x 170mm), 试管振荡器。 2、试剂 氯化钠(Sigma) 平板计数琼脂PCA(DIFCO) 3次超纯水 3、试剂配制方法 （1）0.85% NaCl (250 ?) NaCl 2.125 g3次超纯水250 ?，121 ℃15分钟灭菌。 (2) Plate Count Agar （100 ? ） Plate Count Agar(DIFCO) 2.35 g3次超纯水100 ?，121 ℃15分钟灭菌。 (3) 0.85% NaCl (100 ?) NaCl 0.85 g3次超纯水100 ?,搅拌均匀溶解后, 分装到试管中（9 ?/test tube），121 ℃15分钟灭菌。 所有微生物实验中，除均质在无菌室进行，其余的操作都要在超净工作台内。 实验步骤 （1）无菌操作取25g或25ml样品，加入 225 ?灭菌生理盐水；均质2分钟。 （2）取 1? 样液加入到9 ?生理盐水试管中。 （3）依次做10倍梯度稀释。 （4）从合适的梯度中取1 ?加到无菌平板中（做2个平板），加入 20 ?平板计数琼脂，混匀。 方向： （5）冷凝后放到35±1℃培养箱中培养24~48h。 （6）菌落计数 ★ 菌落总数试验方法 称量样品25g +0.85% NaCl 225? → stomaching 2min↓取均质后的1? 溶液加入到9 ?灭菌生理盐水试管中，vortexing→ serial dilution↓从合适的稀释度取1 ? 加到平板中，每个稀释度做2个平板↓倒45℃左右PCA(plate count agar)，15-20ml/平板↓待平板凝固后培养：35±1 ℃　 48h↓ 菌落计数（counting）4． 菌落计数 (所有菌落定量实验都采取这种方法) 韩国方法中要求每个平板中30－300内的计数 参照GB/T 4789.2-2003 食品卫生微生物学检验　菌落总数测定　 大肠菌群 定性实验： 1. 实验材料 电子天平,锥形瓶(500 ?), 高压灭菌锅,生化培养箱(35 ℃),均质器,试管，移液枪，吸管(10 ?, 1?),无菌平板(直径9~10 cm,高1.5 cm), 磁力搅拌器、搅拌棒，试管振荡器，载玻片、盖玻片，酒精 2. 　试剂 NaCl Brilliant Green Lactose Broth (DIFCO) EMB Agar (DIFCO) 营养琼脂 (DIFCO) 3次超纯水 革兰氏染色试剂条 (MERCK) 3. 试剂配制方法 0.85% NaCl (250 ?) NaCl 2.125 g3次超纯水250 ?，121 ℃15分钟灭菌。 Brilliant Green Lactose Broth4g到100ml3次超纯水中，搅拌溶解，分装到试管中（10ml/管），每管加入一个小导管，121 ℃15分钟灭菌。 (2) Brilliant Green Lactose Broth (100? ) (3) EMB Agar (DIFCO) (100? ) EMB Agar 3.6g3次超纯水100 ?，121 ℃15分钟灭菌，冷却至45℃倒平板，15-20ml/皿 。 Nutrient Agar (DIFCO) (100? ) Nutrient Agar (DIFCO) 2.3 g3次超纯水100 ? ，121 ℃15分钟灭菌，冷却至45℃倒平板，15-20ml/皿 。 4. 实验步骤 (1) 无菌操作取 25 g　样品，加入225ml 灭菌生理盐水,均质 2　分钟。 (2) 取　1ml 样液加到 10ml BGLB (2 管，带小导管) 中。 1 ? 10? BGLB （3）把试管放到35±1℃ 中培养 24~48h；取产酸产气的试管在 EMB 平板上划线。 （4）把EMB平板放到 35±1 ℃培养箱中培养 24±2h。 （5）挑取有金属光泽的菌落划线到营养琼脂上, 35±1 ℃培养 24h。 （6）将菌落革兰氏染色并镜检；用API 20E 做生化鉴定。 大肠菌群定性实验： 无菌操作取 25 g　样品，加入225ml 灭菌生理盐水,均质 2　分钟↓取　1ml 样液加到 10ml BGLB (2 管，带小导管) 中↓35±1 ℃, 24~48h  取产气的试管在 EMB 平板上划线↓35±1 ℃, 24±2