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作业：举例说明免疫学常用的分子生物学方法 下面我主要浅谈一下免疫学中细胞因子检测技术常用的分子生物学方法 机体的免疫细胞（如淋巴细胞、单核—巨噬细胞）及非免疫细胞能产生不同种类的细胞因子，它们在免疫应答中起调控作用。细胞因子检测是判断机体免疫功能的重要指标，对某些疾病的诊断、病程观察、预后判断等是十分必要的。目前常用的检测细胞因子的方法主要有生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法。 分子生物学测定法：应用细胞因子核酸探针（cDNA或基因组等探针）检测，通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子mRNA的表达，可用斑点杂交、Northern印迹杂交及原位杂交等方法检测。 （1）细胞因子的DNA检测 主要用于检测细胞因子的基因有无缺失、放大、突变及某些细胞因子的多态形分析。常用的方法有Southern印记、PCR、原位杂交及原位PCR等。 1）Southern印记杂交：Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用 HYPERLINK /view/1035220.htm \t _blank 琼脂糖凝胶电泳分离经 HYPERLINK /view/48578.htm \t _blank 限制性内切酶消化的 HYPERLINK /view/758.htm \t _blank DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至 HYPERLINK /view/106555.htm \t _blank 尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记 HYPERLINK /view/102276.htm \t _blank 探针进行 HYPERLINK /view/107223.htm \t _blank 杂交，用 HYPERLINK /view/963570.htm \t _blank 放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 2）PCR： HYPERLINK /view/29641.htm \t _blank 聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由 HYPERLINK /view/20616.htm \t _blank 高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有 HYPERLINK /view/552529.htm \t _blank 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于 HYPERLINK /view/8563.htm \t _blank 基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无 HYPERLINK /view/3687.htm \t _blank 细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 3）原位杂交与原位PCR： 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。 原位PCR：是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定量定位分析。 (2) 细胞因子mRNA表达的检测 常用的方法有Northern印记，RT-PCR，原位杂交及原位PCR等。原位杂交是在组织细胞切片上用标记的核酸探针检测胞质内的特异mRNA；而检测细胞内低拷贝mRNA的方法则用原位RT-PCR。 1）Northern印记杂交：Northern blot被用于研究特定类别的RNA分子的表达模式(丰度和大小)，是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交。 Northern印迹杂交的RNA吸印与Southem印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’一羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗