胃癌 趋化因子.docVIP

CXCR4趋化因子胃癌转移侵袭的实验研究 目的:胃癌的腹膜种植转移是影响胃癌患者预后的重要原因之一。文献报道在胃癌术后复发的类型中,腹膜种植约占50%,目前其发生机制尚不明确,且缺乏行之有效的防治手段。趋化因子受体CXCR4(CXC chemokine receptor4,CXCR4)是组织表达最为广泛的趋化因子受体之一。研究发现CXCR4的异常活化与乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等恶性肿瘤发生发展密切相关,肿瘤细胞可能通过活化的CXCR4信号影响肿瘤的发生发展进程,但CXCR4与胃癌侵袭转移的关系如何,经系统文献检索至今尚未见报道,鉴于此,本课题首先观察胃癌不同组织中CXCR4的表达及其与胃癌临床病理参数之间的关系,随后构建CXCR4-siRNA慢病毒载体转染胃癌细胞MKN-45,以特异抑制胃癌细胞MKN-45中CXCR4的表达,观察其阻抑效应;再建立裸鼠胃癌腹膜种植转移模型,观察胃癌细胞腹膜种植转移的变化情况,由此揭示CXCR4在胃癌腹膜种植转移中的作用及可能机理,为胃癌腹膜种植转移防治提供新思路。 方法: 1.收集90例外科手术切除胃癌标本和30例正常胃组织,应用免疫组组织化学方法检测CXCR4、SDF-1和VEGF-C的表达,系统分析它们与临床病理参数之间的关系,研究三者在胃癌不同组织中的表达与胃癌侵袭转移的关系。 2.构建CXCR4-siRNA慢病毒载体并直接感染胃癌细胞株MKN-45。实验分成6组:正常对照组(SDF-1α阴性)、正常对照组(SDF-1α阳性)、空病毒载体组(SDF-1α阴性)、空病毒载体组(SDF-1α阳性)、CXCR4-siRNA载体转染组(SDF-1α阴性)、CXCR4-siRNA载体转染组(SDF-1α阳性)。采用MTT试验、流式细胞、趋化实验(Transwell小室法)、RT-PCR、Western blot等技术,比较研究了CXCR4-siRNA慢病毒载体转染前后及SDF-1作用前后细胞增殖、细胞凋亡、细胞趋化的变化和对胃癌细胞株MKN-45胞浆VEGF-C、NRP-1表达的受抑程度。 3.建立人胃癌细胞裸鼠腹腔种植转移模型,观察CXCR4-siRNA慢病毒载体对胃癌细胞裸鼠腹腔种植转移的影响。 结果: 1. CXCR4阳性表达主要在胃癌细胞的细胞膜和/或细胞质中。在90例胃癌原发灶、71例胃癌转移的淋巴结和9例腹膜转移灶中表达率分别为83.33%(75/90)、90.14% (64/71)和100%(9/9),30例正常胃组织中未见CXCR4表达。VEGF-C阳性表达主要在癌细胞的细胞质,正常胃组织中VEGF-C表达阳性率为6.67%(2/30);胃癌组织中VEGF-C表达阳性率80.00%(72/90),胃癌转移淋巴结中VEGF-C阳性率为91.55% (65/71)。而胃癌腹膜转移中VEGF-C阳性率为100.00%(9/9),与前四组相比,具有显著性差异(P0.01或P0.05)。SDF-1阳性表达主要位于癌细胞胞质和胞浆内。SDF-1在正常胃组织中的表达呈强阳性,阳性率为93.33%(28/30);SDF-1在胃癌组织中的阳性表达率明显降低,胃癌组织中SDF-1阳性表达率68.89%(62/90),胃癌淋巴结转移中SDF-1阳性表达率42.25%(30/71),胃癌腹膜转移组织中SDF-1阳性表达率11.11%(1/9),与正常胃组织相比,差异均具有显著性(P0.01或P0.05)。CXCR4、SDF-1和VEGF-C在胃癌原发灶中的表达与肿瘤的分期、浸润深度、分化程度及淋巴结转移相关(r=0.337,P0.05),与病人的年龄、性别、肿瘤的部位及大小无相关性(P0.05)。结果表明肿瘤的浸润深度、肿瘤的大小和原发灶中CXCR4、SDF-1的表达构成了胃癌淋巴结和腹膜转移的危险因素。 2.成功构建了CXCR4-siRNA慢病毒载体。CXCR4-siRNA慢病毒载体直接感染胃癌细胞MKN-45后,细胞生长受到明显抑制,抑制作用呈时间依赖性;转染后细胞周期分布中,G0/G1期比例增高,而S期和G2/M期比例降低,细胞的增殖指数亦明显降低(P0.05),细胞的凋亡指数明显增加(P0.01),显著抑制胃癌细胞MKN-45的趋化运动能力(P0.01)和VEGF-C、NRP-1的表达(P0.01)。 3.建立各转染组胃癌细胞裸鼠腹腔种植转移模型,CXCR4-siRNA慢病毒载体转染组与对照组、空病毒组裸鼠比较,腹水产生时间、腹水量、腹膜种植瘤最大直径、最大重量、种植瘤数目、生存时间、存活率、生命延长率相比均有显著性差异(P0.01或P0.05);CXCR4-siRNA慢病毒载体组肿瘤抑制率为59.58%;种植瘤细胞周期分布情况:CXCR4-siRNA慢病毒载体组与对照组、空病毒组细胞比较,G0