实验二SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量2015.9.23资料.ppt

实验二　 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）测定蛋白质相对分子质量 ;一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤;一、实验目的;二、实验原理;什么是电泳？;影响带电粒子在电场中泳动的因素;3．电场强度： 电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。 一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。 但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物大分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。;4．电渗： 液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。 由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带??反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。;5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。;电泳技术的分类;3．根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续pＨ电泳：①连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变，②不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4．根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电泳。 5．根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。 6．根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白质电泳等 ;电泳示踪剂;十二烷基磺酸钠(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+; 蛋白质变性 0.1-1% SDS 0.1 M beta-巯基乙醇 蛋白质与SDS分子按比例结合 1 ：1.4; SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系 ;丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～100 μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基的相对分子质量。 ;聚丙烯酰胺凝胶性质;聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种： （1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。 （2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。;不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 浓缩效应在浓缩胶中进行；电荷效应和分子筛效应在分离胶中进行。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。;三、实验步骤;分离胶的制备;加入分离胶溶液 pH 8.8;浓缩胶的制备;;浓缩胶对蛋白样品具有压缩堆积作用。凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选pH6.8的TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。大大提高了电泳的灵敏度。;牛血清白蛋白;三　加样;四　电泳;;五　剥胶;六　染色和脱色 ;七、 Mr的计算;八　转膜 胶放在3张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（15