第2章基因工程制药5678节.pptVIP

第五节 基因工程菌生长代谢的特点;菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。; 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。 ;一、菌体的生长与能量的关系;分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。;大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 ;二、菌体生长与前体供应的关系;质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。如：三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 ;“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延伸过程减少转录。;它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。影响核糖体浓度（降低）;第六节 基因工程菌的不稳定性;一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素： ⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（质粒丢失率）； ⑵这两种菌（含质粒菌和不含质粒菌）比生长速率差异的大小。 ;质粒稳定性的分析方法;二、提高质粒稳定性的方法; 2.合适的载体 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，如果增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。 ; 菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有影响。高生长速率时质粒拷贝数下降，但质粒稳定性增加。;3.选择压力：在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。 4.分阶段控制培养：由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 5.控制培养条件：调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度;含质粒的基因重组菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。 通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。 ;第七节 基因工程菌中试;菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产 物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图;基因工程菌中试;第八节 重组工程菌的培养; 2. 补料分批培养（fed　batch　culture） 是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基（溶氧控制、流加补料），使菌体进一步生长的方法。 良好的生长环境，延长对数生长期，获得高密度菌体。 ;二、基因工程菌的培养工艺;工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。 对发酵影响较大的几个因素有： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍诱导表达程序的影响 7.pH的影响 ; ⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。 还有无机盐、维生素等。 ;不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。 使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。;在氮源中，酪蛋