EGFP蛋白质的克隆表达.docVIP

PAGE  PAGE 12 EGFP大肠杆菌克隆与表达 一 实验目的 （一）掌握用PCR技术进行克隆扩增的方法。 （二）掌握利用琼脂糖凝胶电泳同时进行PCR扩增产物的监测和纯化的方法。 （三）掌握进行DNA片段限制性内切酶双酶切的方法。 （四）掌握用T4DNA连接酶完成DNA片段的连接。 （五）通过转化实验了解在大肠杆菌里表达真核蛋白质需要的不同的培养条件；观察到由于表达了EGFP蛋白质而发绿色荧光的菌落。 （六）掌握重组子转化子的纯化和重组子鉴定的一般方法。 二 设备、材料与试剂 （一）设备 PCR仪、微量移液器、PCR薄壁管、凝结图像分析仪、电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴（台板）、电子天平、EP管、恒温培养箱、恒温摇床、无菌工作台、低温冰箱。 （二）材料 PCR反应成分：Pfu酶、引物、dNTP、EFGP模板质粒pEGFP-C1等。 电泳缓冲液各成分、表达载体pRSETA、IPTG、LB培养基成分、琼脂粉、手术刀、玻璃试管、三角瓶、枪头、塑料离心管、感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α。 （三）试剂 PCR酶试剂：2×Pfu PCR Master Mix DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ T4 DNA连接酶及随酶的10×反应缓冲液 质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素、氯霉素 IPTG储夜（200mg/ml）：在800μl