第1节间接法测抗体.docVIP

第一节 间接法测抗体1. 基本原理 将特异性抗原包被在固相载体上，形成固相抗原，加入待检标本（含相应抗体），其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体，亦称二抗），与上述抗原-抗体复合物结合。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色。 2. 试剂与设备z 纯化抗原。z 酶标抗体（辣根过氧化物酶标记抗人免疫球蛋白）z 底物 (邻苯二胺OPD或四甲联苯胺TMB)z 底物缓冲液（Na2HPO4 0.184g +构椽酸0.047g + H2O10ml + H2O2 5ul）z PBS（见附录）z pH9.6碳酸盐缓冲液CBS（见附录）z 洗液（PBS +0.05%体积的Tween20）z 稀释液（100ml PBS + 1g牛血清血蛋白）z 终止液（２mol/L H2SO4）z 酶标板（聚苯乙烯板）z 微量加样器z 吸水纸z 封口胶带z 酶标仪z 洗板机等。3. 实验步骤一 予试验（一）抗原包被的酶标板的制备１. 以碳酸盐缓冲液将抗原稀释成适当浓度（参考：5ug/ml），加入酶标板（50ul/孔），以胶带封口，于4℃过夜。２. 弃抗原液，以双蒸水冲洗3次，自然干燥后以胶带封口。此为已知抗原包被的酶标板，备用。（二）底物浓度的摸索在底物缓冲液中加入不同量的底物（参考：5mg/10ml），加入酶标板中（50ul/孔），以胶带封口，37℃避光保存2h，在没有明显变色的条件下选择尽可能大的底物浓度。（三）酶标抗体浓度的摸索 1用稀释液稀释酶标抗体至适当倍数（参考：40~4000倍），加入已包被抗原的酶标板中（50ul/ 孔），封口后于37℃作用30min。以洗液连续冲洗5次，然后于吸水纸上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h，在没有变色的条件下选择尽可能大的酶标抗体浓度。（四）待测标本浓度的摸索选择明确为阴性的标本，以稀释液做适当稀释（至少5倍以上，参考：100倍），封口后于37℃作用1h，按上述条件洗板（连续冲洗5次），加入已确定浓度的酶标抗体，再洗板，再加入已确定的底物，选择无明显发色的最大浓度的标本。二 正式试验１. 以稀释液将待检标本做适当稀释（予试中确定）加入包被有已知抗原的酶标板中（50ul/孔），加封口胶带于37℃作用30min.２. 弃反应液，以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。３. 加入酶标抗体（浓度在予试中确定）。加封口胶带后于37℃作用30min。４. 重复第2步.５. 加底物（浓度在予试中确定），加封口胶带后于室温下避光作用5-60６. min，其间不时观察，显色满意后加终止液50ul/孔。７. 于酶标仪测定OD值，OPD用492nm测定，TMB用450nm测定。注意事项１. 每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照（以PBS代替标本），后者为本底值，在分析实验结果时应扣除本底值，阳性对照阴性对照空白对照实验成立。２. 常规ELISA宜用1%BSA封闭包被有抗原的孔，但经验表明这样做往往会较大程度地降低实验灵敏性，必要时可用含0.05%Tween20的 PBS液代替1%BSA对酶标板进行封闭（４℃过液），通常将各种反应条件予试好，可省略封闭步骤。３. 将牛乳以滤纸过滤，加等量的PBS可代替稀释液使用。４. 样本不宜在包被有抗原的酶标板中直接进行稀释，而应另取一块空板将标本稀释后再把标本移到包被有抗原的酶标板中。５. 手工冲洗时应确保洗液不从孔中溢出，用洗板机冲洗时，应确保各道冲洗头进出洗液通畅。６. 底物采用OPD较灵敏，但稳定性差，TMB较稳定，但灵敏度稍逊。７. TMB可配成1%的溶液保存，用底物缓冲液临用时稀释使用，在予试中实际是确定二者配合的比例，确定完毕后可将二者调成等体积的应用液。分装后分别于-20℃冻存，每次使用时取出一对混合后使用，可使用2个月。８. 阴性对照稍有显色为最佳终止显色时间，这一时间宜控制在10~30min，适当延长（如1h）可稍有增敏作用，时间太短需重摸实验条件。 2９. 以酶标记抗体详见第二篇。参考文献１. Reen DJ. 1994. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32:461-6.２. McLaren ML, Lillywhite JE.1981. Indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): practical aspects of standardization and quality control. Med Lab Sci. 38(3):245-51.３. Khatkha