实验4、质粒D的NA的转化.ppt

实验四、质粒DNA的转化; 一 实验目的;一、实验目的;转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。 当受体菌处于感受态时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子（transformant）。;三、材料仪器; 实验材料 大肠杆菌DH5α感受态细胞； 质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)； LB固体培养基； 含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp和Kan储存液，使终浓度分别为50μg/ml，摇匀后铺板。;1．从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上； 2．每组分别取2管20μl感受态细胞悬液； 第一管为转化实验组：1μl重组质粒DNA+20μl感受态细胞； 第二管为阴性对照组；加入1μl无菌水+20μl感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟； 3．将管放入42 ℃恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2 min；;4.向上述eppendorf管中加入200uL LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养20min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因； 5.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Kan+Amp的筛选平板上，涂布之后，在37℃培养箱中正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16小时； 6. 涂布细则如下表：;;;涂布棒的使用;;六、结果讨论;2．质粒DNA的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50 μl的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。 ;3．试剂的质量 化合物及???机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。 4．防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 5．整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。;七、思 考 题;Thank you!