实验四：酵母的菌形态观察及计数.ppt

酵母菌形态观察及微生物直接计数法;酵母菌形态观察及微生物直接计数法;一、目的要求: 1、观察酵母菌的形态特征及出芽方式。 2、了解血球计数板计数原理，掌握显微 计数的原理及方法 。;二、实验原理: 1.酵母菌 酵母菌是单细胞真核生物，菌体比细菌大且不运动。繁殖方式以无性为（芽殖或裂殖）有性繁殖产生子囊和子囊孢子。 ;2.酵母死活细胞鉴别的理论依据： 本实验通过美蓝染液水浸片观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞 则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 ; 直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。;4.血球计数板的构造; 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 ;计数区边长为1mm，高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。 在计数时，通常数五个中方格的总菌数N，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数,最后乘以稀释倍数M。 计算公式： 25个中方格 1ml菌液中的总数=N/5×25×10000×M=50000N×M（个） 16个中方格 1ml菌液中的总数=N/5×16×10000×M=32000N×M（个）;5.计数原则 1.在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5~10 个菌体为宜。 2.每个计数室选 5 个中格（可选 4 个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。 3.位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。 4.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。 5.计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样 品的含菌量。 ;三、实验操作:;2.死活细胞鉴定美蓝浸片观察 （1）在载玻片中央加一滴0.1％美蓝染色 液，挑菌混匀； （2）倾斜缓慢放置盖玻片； （3）放置3min后镜检； （4）染色半小时后再次进行观察，注意死 活细胞数量是否增加； ??(5) 用0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 ;3.血球计数实验操作 （1）镜检计数室：去污，清洗，吹干； （2）加样品：盖上盖玻片，菌悬液于边缘滴一小滴，渗入，使充满菌液； （3）显微镜计数：加样后静止5min，每个小格内5－10个菌体，取5个中格（可选4个角和中央的一个中格）计数； （4）清洗 （5）计算菌浓度;思考题: